人体外伤模型和全山染色方法，以准确评估皮肤修复

在本文中，我们提出了一个优化的前体内人体皮肤损伤方案，可以提供重要的疗效数据作为临床转化管道的一部分。该技术的主要优点是，它允许高吞吐量准确评估伤口修复在活人皮肤。展示这一程序的将是博士后研究员伊丽莎白·罗伯茨和我们实验室的研究助理亚历山大·基德。

要准备皮肤组织样本以进行伤口，请将皮肤真皮侧放在 90 毫米的培养皿中，并使用无菌剪刀去除脂肪组织。当所有的脂肪都被去除后，将皮肤放在25毫升的HBSS中，在室温下补充抗生素10分钟，间歇性摇晃，以去除脂肪组织中的任何残留血液。10 分钟后，用 25 毫升 DPBS 冲洗皮肤。

10 分钟后，重复 HBSS 冲洗，不使用抗生素，然后在 25 毫升 DPBS 中进行最后冲洗。然后将无菌尼龙过滤膜放在吸水垫堆上，在 90 毫米的 Petri 盘中干燥无菌纱布上的皮肤皮肤侧，以去除残留的 DPBS。将干燥的皮肤真皮侧放在干净的 90 毫米 Petri 菜盖上，以去除任何残留的 DPBS，用新鲜的无菌纱布擦干表皮。

要造成伤口，请按两毫米活检冲压皮肤，同时紧握皮肤并轻轻扭动。使用弯曲的齿状组织钳子，拾取直径约两毫米的伤口的每一侧，并在伤口下钩上弯曲的虹膜剪刀。使用六毫米活检冲床对中央两毫米伤口进行活检，在中心形成一个六毫米的外植，部分厚度为两毫米伤口。

然后将伤口除状表皮侧放在尼龙过滤膜堆上，在32至37摄氏度和5%的二氧化碳下进行一至七天的孵化。对于荧光染色，在 1.5 毫升微中心管中收集伤口除菌剂，每管含有 500 微升皮肤固定剂，并在 4 摄氏度下在夜间孵育外植物。第二天，用一毫升染色洗涤缓冲器替换固定剂。

洗涤后，用大约150微升的阻塞缓冲器覆盖每个样品，并在室温下孵育一小时。去除阻塞缓冲液后，加入150微升原发抗体稀释在阻塞缓冲器每管，并在4摄氏度下在一夜之间孵育伤口。第二天早上，用500微升的染色洗涤缓冲器冲洗样品，其中含有0.2%的钠酸，然后用常规洗涤缓冲器冲洗三次。

洗涤后，在每个井中加入150微升的适宜荧光结合二级抗体，稀释在染色洗涤缓冲器中，在室温下孵育一小时。在孵化结束时，在每次洗涤的 500 微升染色洗涤缓冲器中对除菌剂进行三次冲洗 30 分钟，然后在室温下用 150 微升 DAPI 对每个除菌器进行反染，持续 10 分钟。最后，每次洗涤用500微升洗涤缓冲器两次，每次清洗30分钟。

对于植物成像，将 60 毫米培养皿放在共聚焦显微镜的成像平台上，并在盘中添加大约一毫升的 DPBS 层。使用钳子将伤口移植到盘子中。在为实验设置相应的成像软件后，将伤口放置在成像平面的中心，并获取伤检的图像。

要进行无线数字显微镜成像，以经济高效的方式获取高质量图像，将手机或笔记本电脑连接到无线数字显微镜。将外植物侧面放在一块实验室组织上，并从样品中取出任何残留的洗涤缓冲液。然后将外植位于显微镜视野的中心，然后使用连接的摄像机获取图像。

免疫过氧化酶和免疫荧光可用于整个安装组织染色。此外，活/死染色可以在新鲜组织上进行，并在固定前或修复后成像。伤口的整个安装污渍可用于以可重复的方式确定伤口闭合率。

在这个具有代表性的分析中，在四到五天后观察到健康的皮肤伤口闭合，而糖尿病皮肤伤口未能在七天分析期内完全关闭。K14 表达在第二天达到健康皮肤伤口的峰值，然后随着表皮分化的增加而迅速下降。这种重新表皮化和随后的表皮分化在糖尿病皮肤伤口中被延迟。

早期表皮屏障的改造排除了分化表皮层内K14抗体渗透。在重新表皮化过程的早期，K14 正基底层角膜细胞在开放性伤口上向内迁移，使表皮更接近外伤口边缘比表皮更靠近内伤口边缘。在修复阶段的后期，K14 染色丢失，因为表皮与外部内脏不同。

整个安装染色也可用于研究皮肤中其他伤口相关标记的表达和定位，以及伤口部位在愈合的不同阶段存在感兴趣的免疫细胞。产生可重复的切除伤口起初可能具有挑战性。我们建议使用多余的皮肤练习伤口程序。