使用氟磷钙标签和纳米粒子跟踪分析估计人类泌尿纳米晶体

本协议可以专门检测人类尿液中含钙的纳米晶体。这项技术可能有助于预测肾结石形成的早期阶段以及与晶体尿素相关的其他疾病。证明这个程序的将是帕文·库马尔博士，我实验室的研究员IV。

让参与者在三天内食用低草酸盐饮食，并在一夜之间快速食用。然后从参与者收集24小时的尿液样本，然后让他们消耗草酸盐。给参与者喂一个含有水果和蔬菜的冰沙，草酸盐负荷约为8毫摩尔。

让参与者在牛皮后24小时收集尿液，并在第二天返回。在处理前在室温下保持所有尿液样本。测量和记录尿液 pH 和尿样体积。

彻底混合，将 50 毫升尿液加入标记的无菌 50 毫升圆锥管中。使用台式离心机在室温下将样品在 1200 倍 G 下离心 10 分钟。丢弃超自然物，然后用五毫升100%乙醇再次清洗并补充颗粒。

使用台式离心机在室温下将样品在 1200 倍 G 下离心 10 分钟。丢弃超自然物，在100%乙醇的一毫升中补充颗粒。将样品存放在零下20摄氏度以供以后处理，或立即对样品进行染色。

以1:1000的比例在超纯水中稀释100纳米大小的金纳米粒子，并用于优化仪器的设置。在用5毫升Flo-4 AM染色之前，在水中稀释尿液样本20次，在黑暗中30分钟，使用NTA分析样本。在 NTA 分析之前，准备文本稿件中描述的草酸钙和磷酸钙晶体。

打开计算机和仪器，然后打开软件并打开相机。单击窗口左上角的捕获图标以启动捕获模式。首先使用一毫升注射器将空气泵入平台，直到平台看起来清洁。

轻轻地将水加入仪器两到三次，并使用另一个一毫升注射器去除任何气泡。平台清洁后，加入水，通过查看摄像机检查表面是否有污染，然后将金纳米粒子作为控制样品装载泵喷油器，以设置仪器。将屏幕上或旋钮上的摄像头级别调整到仪器的右侧，直到图像开始显示彩色像素，然后降低相机水平。

接下来，调整屏幕以优化图像。左键单击视频图像上的鼠标按钮。按住左鼠标按钮，上下拖动图像以获取整个视图。

设置输液速度并对焦相机，使金纳米粒子在相机屏幕上可见。将输液速度设置为高，以便进行初始设置，以确保检测到金纳米粒子。一旦检测到，将速度降低到每分钟 50 微升，以可视化金纳米粒子。

调整相机水平以可视化粒子。对于未染色的样品，在五级调整屏幕增益，以实现相机对焦，并将相机级别设置为 8。设置焦点后，记录示例。

优化后，在评估其他样品之前，再次用水清洁设备，以确保管子清洁且颗粒不存在。要分析染色样品，将相机调整到包含适当荧光滤光片的滤光片位置，并将稀释和染色样品加载到样品装载泵喷油器上，将速度降低到每分钟 20 微升，以便进行分析。将屏幕增益调整为 5，将摄像机级别调整为 13。

每次测量后保存数据。计算每个样本所有五个读数的纳米粒子的平均数，并使用平均值的标准偏差或标准误差分析数据。使用 T 测试进行配对分析。

Fluo-4 AM 能够与草酸钙晶体结合，这些晶体的大小在 50 到 270 纳米之间，平均浓度为每毫升 12.6 亿颗粒，磷酸钙晶体的平均浓度在 30 至 225 纳米之间，平均浓度为每毫升 22.2 亿颗粒。在草酸盐负荷之前收集的24小时尿液样本中含有一些大小在110至300纳米之间的尿纳米晶体。相比之下，后氧化物样品中的泌尿纳米晶体显著增加。

为了确认该方法的可重复性，对样品进行了三次测量，技术复制品没有显著变化。在尝试此协议时，在机器中添加没有气泡的样品可能会遇到一些困难。为了防止这种情况，在机器中加入空气和水，然后慢慢添加样品。

此外，请务必持续监控样品，并且不存在气泡。这种新方法将在患有草酸钙肾结石病的个体中测试，以监测疾病进展和/或预测肾结石风险。