大鼠骨骼肌中纤维-脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离和表征

由于FAPs是肌肉再生和病理性纤维化的介质，我们的方案允许表征肌肉损伤后的FAP动力学，并分离FAPs用于体外或体外研究。迄今为止，研究仅限于从小鼠中分离的FAPs。我们的方案能够从较大的大鼠中有效分离FAPs，为下游测定提供更大的组织可用性。

延长的组织处理时间会对FAPs的生存能力产生负面影响。如果同时处理多个样品，建议两个操作员串联执行实验方案，以最大限度地提高分离的细胞活力。首先将收获的肌肉组织置于无菌的10厘米细胞培养皿中。

用镊子轻轻撕开并切碎组织，并去除结缔组织，以获得约三到四毫米的立方块。将Minster组织转移到含有6毫升DMEM和1%青霉素 - 链霉素的无菌50毫升锥形管中。接下来，通过加入10微升300毫摩尔氯化钙溶液来激活365微升胶原酶II溶液。

将活化的胶原酶II溶液加入组织浆液中，最终浓度为每毫升250单位。将管子在振荡器中孵育一小时，并在37摄氏度下以240×g孵育，每15分钟手动搅拌一次，以移开粘附在管子侧面的组织。孵育一小时后，向样品中加入100微升胶原酶II和50微升脱酶。

然后，用血清学移液器移液15至20次，直到溶液均勻。将样品在37摄氏度和240×g下再次孵育30分钟，每15分钟手动搅拌一次。用20号针头将肌肉溶液样品通过20毫升注射器缓慢剪切10个周期。

然后，将40微米细胞过滤器放在无菌的50毫升锥形管上，并通过移液五毫升补充10%FBS和1%青霉素链霉素的DMEM来润湿它。通过过滤器一次移取样品一毫升。过滤整个样品后，用补充有10%FBS和1%青霉素 - 链霉素的DMEM洗涤细胞过滤器，以使样品的总体积达到25毫升。

将样品体积均匀地分成两个15毫升的锥形管，并在15摄氏度，400×g下离心15分钟。离心后，吸出上清液并将沉淀重悬于室温下的一毫升红细胞裂解缓冲液中七分钟。然后，加入9毫升洗涤缓冲液，使体积达到10毫升，并在15摄氏度，400×g下离心15分钟。

离心后，吸出上清液并将沉淀重悬于一毫升洗涤缓冲液中。将适当体积的细胞转移到单独的1.5毫升微量离心管中，并将其与台盼蓝染料混合。使用血细胞计数器在光学显微镜上计数活细胞。

对于流式细胞术，将每个实验样品中的1至200万个细胞转移到无菌的1.5毫升微量离心管中。用洗涤缓冲液将样品体积降至一毫升，并将试管放在冰上。设置实验的所有控件。

对于细胞对照，在1.5毫升微量离心管中，将500， 000至100万个细胞等分到100万个细胞的1毫升洗涤缓冲液中，并将其放在冰上。如果实验是首次进行，还应包括单染色细胞悬浮液。要设置磁珠控制，请在每个标记的1.5毫升离心管中加入约150， 000个正补偿微珠。

通过将一半的细胞体积从活化管转移到刷新标记为死的1.5毫升微量离心管来准备活力控制。将死管在65摄氏度下孵育两到三分钟，然后将其放在冰上。孵育后，将死细胞返回活力管。

将单细胞悬浮液（包括实验和对照样品）在500×g和4摄氏度下离心5分钟，并在吸出上清液后将细胞沉淀重悬于100微升洗涤缓冲液中。根据对照或实验条件加入抗体，轻轻轻拂样品，确保完全混合。然后，将它们在黑暗中的冰上孵育15分钟。

对于补偿珠，将管子在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过向单细胞悬浮液中加入900微升洗涤缓冲液和900微升PBS用于补偿微珠对照，将每个样品的体积调至1毫升。将单细胞悬浮液在500 x g和4摄氏度下离心5分钟，补偿珠在300 x g和4摄氏度下离心5分钟。

离心样品后，吸出上清液并将细胞沉淀重悬于300微升洗涤缓冲液中，并在300微升PBS和150， 000阴补偿微球中对照。将细胞样品保存在冰上，并在室温下将珠子样品放在铝箔下。通过设置门控策略来鉴定纤维脂肪原祖细胞和肌原祖细胞，继续进行流式细胞术采集。

在代表性分析中，证实了Sca-1 APC抗体与健康大鼠腓肠肌产生的补偿珠和细胞悬浮液的单染色的成功偶联。在单细胞悬浮液上滴定五种不同浓度的Sca-1 APC，并根据最大荧光强度和最少的背景染色确定抗体的最佳浓度。使用此处显示的门控策略对大鼠腓肠肌中的FAP和MP进行流式细胞术鉴定。

首先对样品进行门控，以排除计数珠中的碎片。然后对细胞进行门控，以通过前散射和侧散射特性排除双倍体。通过用SYTOX蓝染色来评估所得细胞的活力。

对SYTOX蓝光阴性单线态进行CD31和CD45评估，以排除Lin+组分。评估了林族人口。Sca-1单阳性的细胞被指定为FAPs，VCAM-1单阳性的细胞被指定为MP。

在分选后立即进行联合免疫染色，新鲜分离的FAPs群体显示出PDGFRalpha阳性染色，没有受到Pax7阳性细胞的污染。相反，对Pax7染色的MP群体进行排序，没有PDGFRalpha阳性细胞。FAPs在第12天在脂肪生成分化培养基中显示出分化的成纤维细胞和脂肪细胞，分别表达成纤维细胞特异性蛋白1和perilipin 1。

来自成熟脂肪细胞的中性甘油三酯和脂质的存在在油红O染色中很明显。此外，FAPs显示存在I型胶原蛋白和没有污染的肌细胞。第12天在肌原分化培养基中生长的MP显示出成熟肌细胞的存在并融合了多核肌管，并且没有成纤维细胞和脂肪细胞污染。

当使用这种技术分离活细胞进行长期培养时，研究人员必须确保使用无菌技术，同时有效地工作，以确保良好的细胞活力。