我们描述了一种解剖、免疫染色和安装幼虫和成年果蝇大脑的方案，特别强调视叶。鉴于视瓣复杂的三维组织，预计此处描述的协议将使研究人员更深入地理解安装方向与可视化的视瓣结构之间的关系。该协议描述了幼虫和成虫视叶的三种安装策略，每种策略都提供了最佳角度以在成像过程中可视化特定的视叶结构。
在开始解剖之前，用每孔 400 微升 PBS 填充三孔板的所有孔，并使用镊子轻轻选择 15 个游荡的三龄幼虫，这些幼虫在果蝇小瓶或瓶子内侧爬行。将所有幼虫置于三孔板的第一个孔中，并将一个幼虫转移到板的中间孔中。用非惯用手，将幼虫的身体束缚在井的底部，用惯用的手轻轻抓住幼虫的嘴钩。
将嘴钩从身体上拉开，以取出大脑。随后，切除附属组织，包括假想椎间盘。然后将大脑放入板的第三个孔中。
当所有大脑都被解剖后，使用P200移液器小心地从第三个孔中取出PBS，留下足够的溶液以保持大脑浸没。向孔中加入 500 微升新鲜制备的冷固定液。用镊子轻轻搅拌溶液，使大脑在培养皿中旋转，并用玻璃显微镜载玻片盖住孔。
然后将培养皿放在冰上 30 分钟以固定组织。每次洗涤用 400 微升新鲜 PBS 加 triton 洗脑五次。大脑现在已经准备好进行一抗孵育了。
对于成体脑解剖，麻醉 10 至 15 只成蝇，并将它们放在实验室冰上擦拭。使用镊子轻轻地将一只成年苍蝇通过翅膀转移到含有 400 微升 PBS 的三孔解剖板的一个孔中。用非惯用手用一副镊子将苍蝇的胸部靠在井基上，用惯用手用超细镊子轻轻地将苍蝇的头部从身体的其他部分拉出。
用非惯用手将尸体丢弃在实验室擦拭物上，然后用惯用手通过长鼻将头部靠在孔的底部。使用两把镊子剥去眼睛之间角质层的每个区域，直到大脑暴露在外，并去除任何仍然附着在大脑上的附属组织。将清洁过的大脑放入第三个孔中，并如图所示解剖下一个大脑，直到获得 15 个大脑，或者最长解剖期为 30 分钟。
用 500 微升固定溶液在室温下固定大脑 20 分钟，并用 PBS 加 triton 清洗大脑五次，如图所示。成人大脑现在已经准备好进行一抗孵育了。用两滴荧光安全封片剂替换最后一次洗涤液，将液浸没大脑，然后将一滴封片剂滴入新的玻璃显微镜载玻片的中心。
使用镊子通过腹侧神经索抓住每个幼虫的大脑，以便转移到载玻片上。为了观察来自外部增殖中心，椎板或小叶塞中央区域的祖细胞和神经元，请确保腹侧神经索伸出叶，将幼虫脑放在载玻片上，组织的前侧朝上。为了观察属于外部或内部增殖中心尖端的细胞，请确保腹侧神经索从叶下方伸出。
将幼虫脑放在载玻片上，组织后侧朝上。为了在背腹轴和内侧侧轴上看到来自内侧和外侧增殖中心的神经元的新月形，使用一对锋利的镊子或钨针从脑叶之间的裂隙点开始，通过腹侧神经索将脑叶向下分开。重新定向每个叶，使侧面朝上。
当幼虫的大脑定向适当时，在大脑的两侧放置一小滴安装介质。将一个盖玻片放在每滴盖玻片上，并将最后一个盖玻片放在大脑上，使左右边缘靠在其他两个盖玻片上，形成一个盖玻片桥。然后使用指甲油密封盖滑桥的边缘，以固定已安装的大脑。
最后一次二抗洗涤后，用 400 μL PBS 进行最后一次洗涤。用三滴荧光安全封固剂替换 PBS，以浸没大脑。在玻璃显微镜载玻片的左右三分之二处加入一滴安装介质。
在每滴水上放置一个盖玻片，以构建一个盖玻片桥。用指甲油密封右盖玻片的外边缘，并在盖玻片之间滴入一滴安装介质。使用镊子轻轻地将大脑转移到载玻片上，并格外小心，以防止损坏视叶。
为了可视化椎板和髓质神经元的细胞体，使用钨针将大脑定向在前方位置，天线叶向外突出。为了可视化小叶复合体的神经元，将大脑向后定向，触角叶朝下，靠在滑动位置。为了在一个平面上可视化所有视叶神经纤毛，将大脑定向为水平位置，将大脑排列在前支架上，然后使用钨针将每个大脑向上旋转 90 度，使其位于腹侧，放在盖玻片的边缘。
当成人大脑的方向正确时，将最后一个盖玻片放在大脑上，使左右边缘与其他两个盖玻片重叠以形成一个桥接器，用指甲油密封玻片。这是幼虫视叶在前安装方向的图像。在前部安装方向上，中央增殖中心的上皮、髓质神经母细胞和层神经元在表面表现为包裹大脑的细胞带。
在更深入的大脑中，在Z-stack的中间，可以看到主要的外部增殖中心上皮及其各自的神经母细胞和神经元。此外，在这些中间切片中可以看到内部增殖中心的上皮和小叶塞的神经元。最深的 Z 切片描绘了大脑的另一侧，外部增殖中心的后端位于那里。
内部增殖中心的浅尖端也存在。请注意，如果将视瓣安装在后面，这些将是第一个可见的结构。这是来自安装在其侧面的光学瓣的图像。
在侧挂件的表面，可以看到叶片新月形，小叶塞新月形位于其臂之间。髓质神经元新月出现在稍深的 Z 位置。这是一张安装在前方的成人视叶的图像。
由于髓质位于前支架的表面，因此髓质皮层立即可见。皮层中的细胞体将其树枝化投射到神经细胞中，可以在中间 Z 位置看到。小叶也出现在这个水平上，垂直于髓质。
在最深的Z位置，即视叶的最后一个神经细胞，小叶板是可见的。请注意，小叶板将是后支架中第一个可见的结构。这是以水平方向安装的成人视瓣的图像。
当大脑侧翻转 90 度到水平位置时，视叶的所有神经细胞和皮质都在一个平面上可见。在执行此协议时，要记住的最重要的事情是在整个协议中保持脑组织浸没在溶液中。如果大脑暴露在空气中，污渍的质量以及最终图像的质量将显着降低。
了解安装方向如何影响光学瓣观察对于实时成像非常重要。幼虫和成虫的大脑可以在几天内进行培养和成像，以跟踪细胞分裂或自身形态的变化。在这里，安装方向至关重要，因为目标细胞类型必须靠近盖玻片，以便在体内最佳检测荧光信号。
