使用分裂的角质按钮的孔膜内皮器官培养模型

该协议提出了第一个研究模型，允许组织性长期培养角膜内皮细胞通过准备分裂角膜按钮实现。通过部分去除外角膜层，内皮细胞损失显著减少，允许角膜内皮细胞的培养至少15天。因此，该模型对于研究特定物质或感兴趣的技术（如灌溉溶液或眼膜粘弹性装置）对角膜内皮的影响具有价值。

在死后接受被移除的猪眼后，使用眼剪刀和大肠杆菌钳切除所有轨道副眼镜。将五到六只眼睛放入五%的碘PBS溶液中，共5分钟，以适当消毒眼表面，并小心每分钟搅拌一次，确保表面完全浸入水中，实现完全消毒。五分钟后，将消毒的眼睛转移到一杯纯PBS上，并小心搅拌，从眼表面彻底清洗碘PBS溶液。

在开始解剖之前，使用钝导管将五毫升注射器填充两毫升刚解冻的胎儿小腿血清，并通过 0.22 微米过滤器将血清应变成 80 毫升无脱酸培养剂。轻轻搅拌混合物，实现血清的均匀分布，并在12井细胞培养板的每个井中加入三毫升的培养基。当板准备就绪时，将眼球转移到眼科手术显微镜下的眼球支架上，角膜朝上，并使用充满 0.9% 氯化钠的注射器将轻微的吸力吸到眼球支架上，将眼睛固定到位。

使用含有标准化镶嵌的颤音，表面切入中央角膜，不超过300微米，并使用大肠杆菌钳和一个带三角形刀片的一次使用手术刀，通过频闪水平切割和去除角膜的部分颤音片段。在实验过程中，将10-0缝合线放在频闪中，使内皮与频闪侧分化，无需穿透角膜内皮，并使用无镶嵌的颤管将切入至全深度，直到到达前眼室。在角膜完全穿透后，可以察觉前眼室的电阻和液体泄漏明显下降。

将获得的分离角膜按钮（包含频闪的一部分、Descemet 膜和角膜内皮）放入 12 孔板的一个孔中，带标签的一侧朝下。然后在培养盘上标上每个井，每个分裂的角膜按钮都有单独的编号，以便进行后续检查时进行识别。收集所有角膜按钮后，将12井板放在细胞培养培养箱中，温度为37摄氏度，二氧化碳含量为5%，湿度为95%，如果超过7天的孵化期，则在第8天更换上经剂。

要进行未污染的检查，在12井板的每个井中加入三毫升的低度平衡盐溶液，并小心地将一个分裂的角膜按钮放入每一个井中，以诱导角膜内皮细胞肿胀，并提高细胞计数的可见性。一到两分钟后，使用显微镜相机获取内皮三个不同区域的至少三张图像，以对角膜内皮的实际状况进行有代表性的印象，并添加一个真实到刻度长度为 100 微米的刻度栏，供以后分析。为防止渗透损伤，在最多五分钟后将分离角膜按钮从溶液中转移回培养基。

要进行染色检查，请将分裂的角膜按钮放在单独的 Petri 盘中，内皮侧向上，并使用移液器缓慢地将 0.25% Trypam 蓝色溶液滴到每个角膜内皮上，每个试样 90 秒。接下来，在使用移液器将0.2%的Alizarin Red S溶液缓慢地滴到内分，90秒后，在0.9%的氯化钠中小心地冲洗按钮。然后像刚才演示的一样对样本进行图像显示。

要为细胞密度和形态评估准备图像，请打开适当的图形编辑软件程序中的图像，并在图像上投射一个真实到刻度的方长为 100 微米。要裁剪比例图条，请使用矩形选框工具与比例图条边框并选择编辑和裁剪。单击文件和新的，然后选择剪贴板。

记下其他图片的相应像素，然后单击"确定"。再次单击文件和 new，然后根据比例栏的长度在弹出窗口中插入计数正方形的宽度和长度（以像素为单位）。选择白色作为背景颜色，然后单击"确定"以选择全部，然后复制所选图像。选择角膜内皮的图像，将正方形粘贴到角膜内皮上。

选择方形图层，将不透明度设置为 30%，然后单击"确定"，然后用 100 微米的幻灯片长度将投影的正方形保存图像。要评估内皮细胞密度，请打开 ImageJ 中投影的正方形的图像，然后打开单元格计数器插件。要计算正方形中的单元格，请单击初始化以计算正方形两侧的内皮单元格，并记录结果。

要评估形态参数，计算每个细胞边界内至少四个细胞的联合会议、特征玫瑰花环形状的外观以及投影方块内的阿里扎林红区。在15天期间，分裂的角膜按钮表明内皮细胞密度稳步下降，第15天内皮细胞层的平均每周百分比内皮细胞损失为4.90%，因此可以对角膜细胞进行形态分析，改造数据约占合并细胞边界的7%，每毫米样本的中位数约为每毫米一个玫瑰形成，每毫米平方大约 13 个正时电池损耗。在这里，在低氧平衡盐溶液的微观评估中，以及用锥蓝和阿里扎林红S染色后，可以观察到角膜内皮的代表性图像。

如果分裂的角膜按钮被培养与内皮侧朝下，广泛的内皮细胞损伤是预料之中的。非分裂角膜按钮因频闪肿胀而显著增加内皮细胞损失，导致Descemet的膜在15天的培养中折叠，而分裂角膜纽扣在15天的培养后表现出大部分保存的角膜内皮，这从分散的守时Alizarin红染色区域就证明，表明单一的细胞被破坏。为了尽量减少细胞损失，在该协议的任何步骤中，应注意不要接触角膜内皮。