利用 nlsgps1 förster 共振能量转移 (fret) 生物传感器可视化细胞赤霉素水平

这种方法可以帮助回答植物开发领域有关生长调节植物激素分布的关键问题。通过使用基因编码的FER生物传感器，例如检测长臂猿的nlsGPS1，可以测量细胞溶液中重要的化合物在阿拉伯组织中的动态分布。一般来说，对这个问题的新鲜人将很难，因为分析F FRET生物传感器涉及比位成像，与意图公制成像相比，比例成像增加了噪音和额外的分析步骤。

首先在1/2 Murashige和Skoog或MS agar方板上播种约20个灭菌的阿拉伯种子。用毛孔手术胶带密封板，用铝箔包裹，在四摄氏度下孵育一到三天，进行分层。对于根成像，在指示条件下，将板以垂直方向转移到生长室三天。

对于深色生长的低磷基，将板转移到生长室一到四个小时的光脉冲，以同步发芽。然后用铝箔包裹板，并将它们以垂直方向放入生长室三天。为了稳定状态测量，在干净的显微镜幻灯片中添加 50 微升模拟溶液，并轻轻地将三个核局部 gibberellin 感知传感器一个或 nlsGPS1 在幻灯片上表达幼苗。

然后，在清洁盖滑的每个角落发现一滴真空润滑脂，然后轻轻地将吸尘油脂盖在幼苗上。小心添加额外的模拟溶液，以清除任何气泡，如有必要。在 Gibberellin 四或 GA4 治疗之前，使用充满真空润滑脂的 20 毫升注射器，并配备经过修改的 200 微升移液器尖端，开口直径为 1 毫米，在干净的玻璃滑梯上绘制一个均匀分层的三厘米半长两个半厘米宽的矩形。

在矩形中心添加 50 微升的模拟溶液，并使用干净的钳子将 nlsGPS1 从它们的科蒂龙下侧提升为表达幼苗，小心地转移到模拟溶液中。将真空润滑脂的盖滑点放置，就像刚刚演示的真空润滑脂矩形中心一样，在不干扰幼苗的情况下，小心地将储液罐填充额外的模拟溶液。然后在配备适当激光的共合显微镜上获取幼苗的图像，用于刺激性的 CFP 和 YFP，以执行福斯特共振能量转移成像。

对于 GA4 进行治疗，请从显微镜阶段取下幻灯片，并设置 20 分钟的计时器。立即从盖滑的右侧取出模拟溶液，同时在盖滑的左侧添加 17 微升四分之一 MS 液体，并辅以一个微摩尔 GA4，直到更换所有模拟溶液。然后将玻璃幻灯片放回显微镜阶段，再等待 10 分钟，然后获取 GA4 后处理图像。

要为感兴趣的组织设置时间课程，在 ibidi 粘滑的灌注通道中心添加 200 微升的模拟溶液，并轻轻地将 nlsGPS1 幼苗放入模拟溶液中，如所证明的。使用钳子轻轻将盖滑在幼苗上，使用钳子的背面轻轻压在盖滑的外边缘，直到它与粘性滑轨外围的粘性材料形成牢固的粘结。接下来，使用两个0.8毫米内径弯头Luer连接器和0.8毫米内径硅胶管将粘性滑杆连接到充满模拟溶液的20毫米注射器，并将滑轨连接到出口容器以收集流出溶液。

轻轻按下柱塞，向腔室分配足够的溶液，以确保没有气泡，然后将注射器加载到可编程注射器泵上。然后启动泵以启动时间过程。对于在时间过程中进行 GA4 治疗，暂停泵以停止灌注，用装满四分之一 MS 液体的注射器替换含有含有注射器的模拟缓冲液，并辅以 GA4。

对于 3D 图像分析，请将文件导入 IMARIS 图像分析软件程序并打开曲面向导。将背景减法设置为三微米，将阈值设置为默认值。在核的分割过程中，注意不要包括荧光暗的核，因为信号接近背景水平的物体的信号噪声配给过低，无法进行比例图像分析。

然后根据使用 YFP 发射创建的表面屏蔽 CFP 和 FRET 发射通道。使用 XT 均强度比扩展计算供体激发接受器发射比除以供体激励供体发射在两个通道中单个表面的均强度值之间。要使用 nlsGPS1 发射比为单个曲面着色，请选择带统计数据的颜色编码，并设置平均强度比作为统计类型。

在统计图标下，从表中导出单个值的比率，然后复制这些值并将其粘贴到电子表格中，以图形表示数据。在 Arabidopsis 根中，nlsGPS1 排放比梯度表示在中分区和低 GA4 水平，在后期伸长区中低 GA 水平。相比之下，在 nlsGPS1 无响应根中未观察到发射比梯度，这表明内源 GA4 梯度不是神器。

nlsGPS1排放比梯度也形成于暗生长的低血小体中，在低血小板中含量较低，在低血小板快速拉长的基底区域形成典型的钩和高水平。相比之下，在 nlsGPS1 非反应性低血性中未观察到排放比梯度。此外，与阿拉伯根系的分区相比，外源提供的GA4在伸长区优先积累，表明nlsGPS1可用于研究内生和外源性GA模式。

此外，对GA4处理的nlsGPS1幼苗进行时间过程分析，发现与分系区相比，外源GA4在根伸长中积累得更快。在尝试此过程时，必须记住在定量成像过程中避免饱和像素，以保持成像参数不变，并最大限度地减少样品灌注期间的漂移和焦变问题。按照这个程序阐述的方法，如成像根生长在根芯片类型控制填充装置可以回答额外的问题，GA梯度如何变化的阿拉伯根尖以不同的速率或响应压力后，其发展，这项技术铺平了道路的研究，在植物生长领域的研究，探索在更多的阿拉伯多普西沙组织和器官的吉百利。