全飞头段耗氧率的测定与解释

这种方法可以帮助回答代谢领域的关键问题，如，代谢活动在衰老过程中如何改变。与传统的线粒体分离相比，该技术的主要优点是使用完整的身体段，其数据与自然和生理状态非常相似。演示这个程序将是阿努普和安妮卡， 一个研究生在我的实验室。

要开始协议，请先在开始实验前一小时打开机器，以便有足够时间达到所需的温度并保持稳定。然后，在软件设置中，在管理模式下，选择墨盒校准的长度和所需的温度。然后，输入以下协议:根据实验设计，在选择测量步骤后，将注入步骤从端口 A 添加到 D。

要检查基本OCR的质量和测定，在通过端口 A.通过端口设置第一个药物的注射时间之前，或测试前至少四小时，通过向每个井添加 1.0 毫升的校准剂，调整协议，然后将传感器盒放在板的顶部。如果墨盒计划水合超过 24 小时以防止蒸发，请用 Parafilm 盖住墨盒。将墨盒存放在 37 摄氏度，无 CO2，过夜。

其次，确保实验药物在新鲜介质中彻底溶解，加上2.5%的葡萄糖。在所需的温度下测量和调整药物溶液的 pH 值，使之达到车辆的 pH 值。将药物溶液放入其分配的注射端口中。

然后将墨盒装入机器并开始校准。使用一个普通 HCl 将新鲜准备的介质加 2.5% 葡萄糖调整到所需的 pH。接下来，准备一个冰盒，在冰上放置一个金属板。

打开眼板包装。将网浸入介质中，用16毫米培养皿。用插入器收集一个网，让插入器站在显微镜旁边。

将一小滴介质添加到连接到插入器的网中。然后，将苍蝇放在冰冷的金属板上，对苍蝇进行麻醉。使用钳子，抓住苍蝇的腹部，并浸入显微镜下的培养皿中的介质中。

使用第二对钳子，轻轻取下苍蝇的头部。将头部放在连接到插入器的网中间，并验证头部是否浸入介质中。在将头部居中之前，先清除多余的液体，避免头部失去，同时将其放入井中。

当网上有16个头时，居中。使用插入器，将网放在井中。确保头部被夹在网下，并缓慢地添加700微升介质加2.5%葡萄糖。

确保用于背景的空井还含有含有 700 微升缓冲液加 2.5% 葡萄糖的网。通过显微镜检查井下有无气泡。使用一毫米移液器轻轻地上下移液器去除任何气泡。

保持头部居中，实现可靠的 OCR 读数。然后将板添加到机器中并开始测量。在协议结束时，取出墨盒。

目视确认端口填充物中没有可见的剩菜。接下来，如果头不用于蛋白质提取，请丢弃墨盒和板。请记住查看氧气和 pH 水平，以便在分析前检测任何异常井。

此外，根据氧气水平选择适当的耗氧率计算也很重要。执行协议后，观察到中年头部的氧含量下降得比年轻的飞头快。当不同条件下的氧气含量范围相似时，最好使用 AKOS 算法自动生成氧气消耗率（OCR），该算法可靠地反映年轻头和中年头之间测量期间的氧气水平变化。

添加甲酸钠，或SB，KDAC抑制剂，瞬时改变氧气水平的动态。虽然车辆控制装置在第一次和最后一次滴答声中显示稳定的氧气水平，但 SB 添加会导致这些滴答声中的氧气水平大幅下降。由于 AKOS 计算会考虑所有滴答声并忽略厌氧状态，因此它会产生一个误导性的 OCR，如非规范化的 AKOS OCR 水平中观察到的，在注入端口 A 时，该固定算法在注入时几乎没有变化。固定算法更密切地对 OCR 和氧气水平变化进行类似，揭示了 SB 治疗时 OCR 的增加。

尝试此过程时，与两个人一起工作非常重要，以确保准备单个板的时间相对短。按照这个程序，其他生化方法，如西布洛特和质谱法可以回答有关分子机制的问题，例如，那些中度代谢改变的问题。