Name: contractility measurements of human uterine smooth muscle to aid drug development
Uploaded: 2018-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
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这项研究得到了奥地利科学基金 (FWF) 通过项目 I3243 和欧洲研究理事会 (紧急救济委员会) 在欧洲联盟的地平线2020研究和创新方案 (赠款协议 714366) 的支持。CWG 得到了澳大利亚研究理事会 (arc) 未来奖学金 (FT140100730) 和 MM 的支持, 由一个 arc 发现早期职业研究员 (DECRA) 奖学金 (DE150100784)。SA 由英国妇女福利管理的哈里斯健康早产研究中心资助。

在与人体组织合作之前, 必须建立适当的机构、伦理审查委员会和人体组织实验的安全批准。本文所述的所有工作都获得了当地研究伦理委员会 (利物浦东部, REC 参考 10/H1002/49) 和研究开发部, 利物浦妇女医院和利物浦大学的机构审查理事会的批准。
注: 本议定书中所描述的所有活检都是从在利物浦妇女医院接受产前择期 CS 分娩的妇女获得的, 每个女性都给予书面知情同意参加。
1. 解决方案
<ol><li>制备改良的克雷布斯生理盐水溶液 (PSS), 其成分如下: 154 毫米氯化钠, 5.6 毫米氯化钾, 1.2 毫米 MgSO4, 7.8 毫米葡萄糖, 10.9 毫米 HEPES, 和 2.0 mm CaCl2。 注: 所制作的容积是根据操作中的组织浴数、系统的流速 (1 毫升/分) 和估计的试验长度 (包括平衡和冲洗时间) 确定的。</li>
	<li>使用4米氢氧化钠调整 pH 值至7.4。</li>
</ol>2. 组织浴设置
<ol><li>用55-60 ° c 的循环水浴将组织浴系统的储层预热到 ~ 45 ° c。 注: 该装置底座上的蓄水池加热至45° c, 在允许与流经的蠕动油管中的 pss 进行热交换后, 确保组织浴中的 pss 处于37° c。为了确保组织浴中的 PSS 温度达到37° c, 可能需要对设定的温度进行一些调整。这将取决于所使用的仪器和设置流速。</li>
	<li>手动开关任何其他必要的设备, 包括放大器, 数据采集和记录系统, 和吸水泵。</li>
	<li>在蠕动泵头的滚筒周围放置每个蠕动进给管 (每槽一管)。安全与固定停止和收紧压缩凸轮和锁定键周围的管。将蠕动进给管的自由端插入 pss 的 1 L 容器中, 启动泵, 使 pss 持续灌注到组织浴池中。</li>
	<li>确保吸入泵运转正常, 溶液在浴缸中的水平是恒定的, 从而使流量进入浴缸等于去除率。组织浴中的 PSS 水平可以通过使用建模者的粘土在浴缸中操纵吸入管的深度来调节。</li>
	<li>通过将已知重量 (相当于 1 millinewton (mN, 力单位)) 放到传感器钩上并记录采集软件检测到的偏转, 来校准力传感器。 注意: 可以在软件中调整值, 使记录的值自动转换为 mN, 而不需要在分析过程中进行任何进一步的转换。在组织安装前必须对力传感器进行校准。</li>
</ol>3. 组织准备和剥离
<ol><li>在婴儿和胎盘娩出后, 在 CS 上收集妊娠人肌 (1-2 厘米3) 的活检。获得 (典型的) 全厚度活检, 其中两个 perimetrium (子宫外浆膜层) 和蜕膜 (子宫最里层的层) 存在。仅使用层组织 (中央肌肉层)。请参见图 1A-b。<ol>
<li>除去 (必要的) 蜕膜和任何附着的胎膜 (如果存在), 因为这些组织是已知的产生物质, 可以改变层收缩力。 注: 在手术中, 样品被放入汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 或新鲜的 PSS 和储存在4° c。理想的组织应在12-16 小时内使用, 但研究表明, 在18小时的收集与存储在4° c51的收缩力不损害。在4° c 长时间贮存后, 必须进行适当的控制以确认组织的活力和功能。这里的样本取自下子宫段切口部位的上缘, 而不是从上段。子宫的下部和上部部分已被证明与类似的48收缩, 因此下段活检被认为是上段层活动的良好反映。</li>
	</ol>
</li>
	<li>准备解剖区域和所需的仪器, 包括: 大解剖剪刀, 小 Vannas 解剖剪刀, 两个解剖钳, 解剖针, 和铝组织夹, 周围的解剖显微镜的固定和变焦放大.</li>
	<li>将活检样品放在一个清晰的基于硅橡胶的解剖盘上 (参见材料表), 并仔细定位活检, 使浆膜和蜕膜边缘被识别图 1B。</li>
	<li>用别针将活检固定在盘子的底部。确保组织在整个解剖过程中保持与 PSS 的水合作用。</li>
	<li>在显微镜光源上手动切换, 并在显微镜下观察10x 放大后的组织, 以确定肌无疤痕组织、浆膜、蜕膜和任何附着的胎儿细胞膜的区域。</li>
	<li>使用大解剖剪刀进行钝性解剖, 将两个相邻的组织层分开, 露出两个平面或肌肉。 注意: 通常在组织层之间找到一个小口袋来开始分离, 但必须注意避免在活检边缘的小血管, 因为它们可能被误认为是 "口袋"。</li>
	<li>在组织的每个角落放置解剖针, 以确保它。检查肌肉的部位, 以平行的纤维运行。 注意: 通过组织的小毛细血管灌注的方向可以帮助区域识别。轻拉在组织边缘也可以帮助确定的方向, 纤维的旅行。</li>
	<li>切掉的组织〜2毫米宽 x 8 毫米长 x 1 毫米厚沿纵向轴与肌肉纤维的方向对准使用小解剖剪刀。 注意: 必须采取的护理, 只有保持组织的初始切边, 以避免损害。</li>
	<li>重复这个过程, 解剖出实验所需的条数。</li>
	<li>将两端的每一条都钉在一起, 以使其伸直并固定在盘子上, 注意不要过度伸展组织。</li>
	<li>在每个末端附上铝组织夹子, 以便他们之间的组织是 ~ 5 毫米长并且仔细地切除任何多余的组织 (图 1C)。</li>
	<li>转移到一个干净的盘装满 PSS 准备安装。</li>
</ol>4. 在浴池中安装组织
<ol><li>将试纸转移到实验性组织浴池。水平地而不是垂直地安装条带 (如传统的器官浴) (图 2B)。</li>
	<li>将每个条带的一端连接到力传感器, 它测量组织的收缩, 另一个在组织腔内的固定钩上。 注: 组织浴的容量是〜1毫升, 这是足够大, 以确保在浴缸完全淹没的条。</li>
	<li>确保在浴缸的每个钩子底部的小条。</li>
	<li>通过双击软件图标打开录制软件。</li>
	<li>调整每个频道的录制, 使其在 "通道" 窗口中处于视图中。</li>
	<li>通过右键单击 y 轴, 选择 "缩放", 并分别输入0和10的最小和最大值, 调整 y 轴刻度以读取 0-10 V (相当于 0-10 mN 后校准)。选择 "确定"。对每个通道记录重复此操作。</li>
	<li>在软件上按 "记录" 开始实时录制。 注意: 如果小条没有固定在每个钩子的底座上, 它们可以在收缩过程中滑动, 这在记录中会出现 "缺口"。设定的张力会改变, 因此收缩后滑动可能会有所不同。</li>
	<li>通过手动转动每个传感器上的动, 在每个浴缸中拉伸组织。跟随向上组织运动从基线在屏幕和继续转动动直到基线紧张到达 0.2 g (~ 2 mN)。 注: 组织将立即开始放松 (以基线张力下降为例), 通常达到1锰之间的稳定张力。在我们的实验条件下, 这种定义的张力已经被优化为这种尺寸的组织条。如果要使用其他大小的组织, 就必须进行适当的长度-张力关系调查, 以优化所用的静力。</li>
	<li>允许组织平衡2小时直到自发收缩。 注意: 基线紧张的小海拔通常是观察到的, 并且是组织生存能力的一个很好的指示, 并且它将是收缩的。</li>
</ol>5. 用40毫米钾 (高钾+) 挑战组织
<ol><li>如果没有自发的收缩发生后 2 h 的安装, 挑战的小条高钾盐溶液, 其中钾升高到40毫米由 isosmotic 取代氯化钠的氯化钾。对于高 K+, 添加以下内容 (在 mM 中): 119.6 氯化钠、40氯化钾、1.2 MgSO4、7.8 葡萄糖、10.9 HEPES 和 2.0 CaCl2。 注: 在光滑的肌肉如肌, 高钾+的应用导致收缩由间接地打开电压操作的钙渠道导致最大的汇集的 Ca2 +入组织细胞。因此, 高 K+可作为测试组织完整性的一般指标的一种措施, 同时也可以实现最大组织响应的度量。<ol>
<li>将送纸器管放置在包含带条的浴缸中, 将其挑战为包含高 K+的玻璃实验室瓶, 用于1-2 分钟。</li>
		<li>将馈电管送回 PSS 的容器。</li>
		<li>在实现对高 K+的响应时, 继续监视该条, 以便进一步1小时。如果没有对高 k+的收缩响应, 或者没有自发活动引起后高 k+响应, 则丢弃该条。 注意: 在评估对高 K+的响应之前, 实验者还需要注意进纸器导管中的死亡空间 (解决方案到达组织浴所需的时间)。这可能需要2-3 分钟, 将取决于流量。</li>
		<li>为了确保从浴缸和馈线管的高 k+完全冲洗, 这可能会影响随后的演习, 等待, 直到自发的收缩返回到前高 k+的振幅, 然后再继续进行实验。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 检测已知和新型化合物对层收缩的影响
注: 测试新药物和试剂对层功能的影响的实验可以在自发 (图 3A) 或激动剂刺激的收缩 (图 3B-c) 上执行。对于激动剂刺激的宫缩, OT 或精氨酸加压素 (VP) 添加到 PSS, 使浓度 0.5 nM, 并在整个实验中使用 (图 3B-C)。OT 的浓度已优化此分析, 因为它提供了在自然的阶段性收缩40,52。激动剂的浓度大于这可能导致长期持久, 持续 (强直) 收缩 (参见 Ref41,44 ), 在这种情况下, 各种药物的作用难以评估, 实验时间框架需要大大扩大, 以适应增加的持续时间单独收缩和减少频率。在这个例子实验中, OT 或 VP 被添加来刺激宫缩, 以使已知的工程机械和 V1aR 拮抗剂, 阿托西班和 SR49059, 或我们的新化合物 [d-Arg8]-inotocin ([d-Arg8] INT) 的对抗性, 可以评估。
<ol><li>在 PSS 中 (有或不含 0.5 nM/VP) 稀释至少 1/1000 稀释剂的浓度, 确保广泛的浓度包括不引起对浓度超过最大值的反应。响应.</li>
	<li>准备一组等量的稀释 (如: 如、二甲基亚砜、乙腈或蒸馏水)。 注意: 通常最容易准备最高浓度,即, 10-6 m (来自 10-3 m 的股票), 然后沿对数刻度执行串行稀释 (如, 10-610-10 m)。要准备的容量取决于应用的时间、仪器的流速和要检查的条数,例如, 对于25分钟的试剂用量和1毫升/分钟的流速, 每个组织浴的每个浓度的最低25毫升是要求署.</li>
	<li>将第一浓度的化合物应用到组织中, 将该组织浴的接驳管放置在一个玻璃实验室瓶中, 该瓶子含有所需浓度的试剂。 注意: 一旦达到了自发或 OT/VP 刺激收缩的稳定基线, 就应该这样做。</li>
	<li>应用相应的车辆控制解决方案, 以同样的方式进行第二次洗澡。</li>
	<li>记录应用程序的时间 (即, 当进纸管更换时)。</li>
	<li>重复每个浓度的过程, 依次将进料管放入包含系列中下一浓度的玻璃实验室瓶中, 然后重复, 直到所有浓度都被应用。 每个浓度的应用可以是在15和30分钟之间, 但应该是一致的每集中应用和在实验之间。那些涉及 OT 或 VP 刺激的宫缩往往需要更长的应用周期 (例如, 25 分钟), 以减少在刺激下观察到的收缩频率。在测试任何新试剂之前, 应先进行初步实验以确定最佳的应用时间。</li>
	<li>将馈电管送回 PSS (带或无 OT/VP) 冲洗。</li>
	<li>单击 "停止" 结束实时录制。立即将数据保存到适当的文件夹, 并将版本导出为 ". 席子" 文件。</li>
</ol>7. 数据分析
注意: 数据捕获和分析可以通过任意数量的商业上可用的数据采集软件包来完成。有关此协议中使用的软件的详细信息, 请参见材料表。为了准确评估收缩活动, 要测量的收缩参数包括: i) 收缩振幅, ii) 收缩的频率, iii) 收缩的时间, 和 iv) 平均力积分 (图 4)。平均力积分等于收缩曲线下的面积, 因此是组织带在给定时间内完成的总功的一个指标。可以对部分或全部参数进行分析。作为最小值, 建议对收缩的平均积分力和振幅进行分析53。在这里描述的实验中, 我们测量了收缩幅度和曲线面积的变化。
<ol><li>将. 席子文件导入分析软件。</li>
	<li>在考虑采样间隔频率的同时, 调整与 X 轴对应的列以反映实验时间。实验通常记录在10赫兹对应10样品/秒或600样品/分钟。</li>
	<li>使用 "绘图" 将数据绘制为 x-y 坐标图行 "功能。</li>
	<li>在软件上使用 "平移垂直" 功能来零收缩基线。</li>
	<li>选择适当的控制期。 注: 这是第一次在应用前的时间在摄政, 但等同于试剂的应用期限 (图 4A)。例如, 如果药物 x 的应用是25分钟, 使用的25分钟前第一次应用药物 x 作为对照。</li>
	<li>读出 Y 轴, 记录在所选时间段内发生的每个收缩的最大峰值时收缩的振幅 (力), 并计算平均值。</li>
	<li>通过在每次收缩的开始和结束处读出 X 轴, 并记录平均值, 来测量这个最大峰值的50% 的收缩时间。</li>
	<li>计算在时间范围内发生的收缩次数, 以生成频率值。</li>
	<li>使用 "集成" 函数计算选定时间段内的 "任意单位, a.u"。 注意: 要准确记录联合自卫队, 必须在 Y 轴上将收缩的基线设置为零。</li>
	<li>依次移动每个浓度并记录不同的收缩参数。</li>
	<li>将控制数据设置为 100%, 并将每个试剂浓度下获得的值表示为此控件的百分比即, 刺激值应为 > 100%, 而放松应为 < 100%。 注意: 以这种方式对数据进行规范化, 将使用户能够比较跨条和药理治疗的结果。</li>
	<li>重复每个实验并将数据传输到一个图形包。</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

虽然大多数药物开发是为了治疗人类疾病, 但大多数基础研究主要是在动物组织中进行的。在这里, 我们描述的方法, 以调查前体内收缩的人肌从手术获得的, 可用于解决许多重要问题, 与子宫生理和病理, 以及验证功能反应以已知和新颖的药理制剂来帮助药物开发。特别是, 我们强调使用这种方法来调查已知的工程和 V1aR 竞争拮抗剂的拮抗反应, 阿托西班的 OT 诱导妊娠层收缩, 以及确定的反应和受体选择性的新开发的选择性 V1aR 拮抗剂, [d-Arg8] INT。我们证明了重要的药动学参数, 如 EC50和 IC50可以计算, 这是很好的与细胞基础的药理数据。
同时使用多个条带可以直接比较多个代理的效果, 与拮抗剂的竞争实验, 以及适当的时间和车辆控制。由于条带通常是以2、4或8组的方式准备的, 因此该技术提供了适度的吞吐量, 从而能够在 6-8 (累计) 浓度 (每次活检) 中测试2-4 化合物。此方法还提供实时数据, 以便能够快速评估效果, 并可以调整协议。此外, 这项技术可以用来测试任何复利, 并已成功地使用了许多研究小组的重点是层生理学和药物发现。除分析纯化合物, 如本文所述, 子宫收缩力模型也可以成功地用于筛选新的宫缩化合物从混合物, 如草药制剂从传统医学7,55,56。
虽然这个模型在技术上是健壮的并且表现出很好的重现性, 但它确实有一些局限性: 对于那些不熟悉组织或使用解剖设备的人来说, 解剖可能是困难的, 因此新用户需要一些时间来优化组织准备和协议。还应该指出, 人类的肌在外观上与其他模型如老鼠和老鼠有很大的不同。大多数啮齿动物子宫是由两个管状的子宫角组成, 每一个完整的卵巢在一端和加入到子宫颈。每个角都有明确定义的纵向和圆形肌肉层, 可以很容易地分离在解剖, 而不同的纤维类型的人肌往往交织形成一个 ' 网状 '。此外, 人类肌的收缩剖面与啮齿动物有很大的不同。最显著的是, 人类肌的收缩频率较低, 但持续时间较长。因此, 与人类肌工作的实验时间通常比啮齿动物模型长得多。不同物种之间受体表达的差异也会导致对激动剂反应的显著差异, 如果在不同物种间推断结果, 则应牢记这一点。
还有许多步骤需要考虑, 以使该系统的输出最大化。关键步骤包括保存组织的生存能力, 例如在处理组织时要小心, 以避免在解剖或安装时发生不必要的损伤。需要熟练的眼睛解剖细条子宫肌, 确保肌肉纤维的方向是在纵向方向和跟随组织的平面, 以及避免疤痕组织, 蜕膜, 和小血管。为了帮助定位的目的, 一旦标本在实验室, 有可能添加一个标签 (如小手术缝合) 在收集时的一侧活检, 以描绘浆膜边缘从蜕边缘。
组织在实验中应保持在稳定的36–37° c, 因为组织功能受温度波动的影响。这可以通过实验室内的一个强健的空调单元来实现。恒定的热稳定的 PSS 的灌注确保了温度的保持以及从收缩中排出的废品。通过改变流速或直接调节水浴温度, 可以改变器官浴中的温度。与传统的5-50 毫升浴缸相比, 小的浴缸尺寸确保了 PSS 和试剂冲洗的相对快速的周转。这里所描述的小型化的器官浴, 也减少了 PSS 和所需的试剂的体积, 从而最小化成本和节省宝贵的, 新开发的化学品。此外, 由于小浴缸的大小和使用基于 HEPES 的缓冲区, 该系统不需要氧合例如, 通过冒泡的 PSS 与卡波金。适用于带材的张力的标准化也很重要。对于这个尺寸的小条 (5 mm x 2 mm x 1 mm), 这应该是大约 2 mN (相当于 ~ 0.2 g)。替代方法包括应用高钾溶液, 以诱导最大收缩和拉伸到这一最大收缩的一半。然而必须注意的是, 张力应用在体内可能不同。
主要的挑战包括从人体获得组织, 但尽管征税, 人体组织清楚地代表了研究人类疾病和药物发现的子宫收缩的最生理学相关 (和奖励) 模型。然而被隔绝的组织小条, 不必要等同于组织在体内, 因为他们是豁免例如, 激素和神经输入, 虽然不是必要的为收缩, 将调节收缩在体内。然而, 这种化验提供了一个机会, 以控制的方式分析层收缩, 从这种影响分离。它还允许对诸如荷尔蒙控制收缩 (例如, 通过 OT, VP, 前列腺素,等) 等因素的影响进行调查, 为层功能的调节提供线索。当组织是从不同的妇女获得, 自然会有一些变化的自发收缩剖面之间的标本。因此, 经常需要在大量的样本 (约为 10) 上进行实验, 以最小化某些数据集53中的变化。这是最重要的比较时, 不同的患者群体之间的收缩活动。将激动剂和拮抗药的反应正常化为控制活动 (即, 表示为控制活动的百分比或高 K+) 可减少某些此变体。此外, 为了减少条纹间的变化, 可以通过测量其长度和重量后试验41来对数据进行规范化, 以去除横截面积。这在比较不同病人群体的收缩模式时特别有用。
这项技术的局限性还包括获得新鲜组织的机会, 这需要与医院工作人员, 特别是剧场工作人员和参与同意程序的人员建立良好的工作关系。当地研究伦理委员会和研究所或医院审查委员会的道德许可也需要到位。收集的人肌是最有可能执行 CS 分娩时, 捐赠者正在接受手术。活检是取自相同的子宫切口, 为分娩婴儿, 因此, 病人不需要接受任何进一步的额外程序。剧院的工作人员和执行活检的外科医生需要知道后续使用的组织, 他们不会被放置到固定的解决方案, 如送往病理科。漫长的实验时间是另一个考虑。人体组织的实验需要多小时 (通常是 > 6 h) (与在大鼠或小鼠子宫中的类似实验相比, 2-3 h), 因为收缩的频率较慢, 组织安装和自发建立的 2-3 h 滞后时间收缩.然而, 正如我们所显示的, 人体组织的收缩是强健的, 并且在建立时可以收缩许多小时而没有明显的疲劳40。
该系统还允许在体内的其他挑战, 包括在怀孕的组织中测试药物试剂的能力, 以克服在活体工作。这种技术可以很容易地外推到其他物种, 包括小鼠, 以初步的结果可以确认之前, 继续进行整个动物研究。温度的控制变化, superfusate (PSS) 的组成和 pH 值可以很容易地模拟不同的场景在体内, 并分析这些变化对复合行为的影响。测量层带内的等距张力的基本原理也可以扩展到测量细胞内钙浓度或 ph 值的同时变化, 使用荧光钙或 ph 值 (H+) 的指标和设备来检测和记录荧光57,58,59,60。
总的来说, 人类肌代表一个健壮的和生理学相关的模型来表征和验证新药发现中的新的治疗化合物-包括纯化合物和混合物。我们提供的例子, 它在药物发现方面的 OT/VP 系统, 并侧重于工程机械和 V1aR 拮抗剂, 以显示如何使用该模型来确定化合物的功效和效力的定义目标和验证配体选择性。然而, 应该牢记, 这项技术可以用来研究任何目标的兴趣或途径, 导致层收缩 (或放松), 以及帮助药物发现新的目标和途径, 并促进我们的理解层生理学和病理生理学。

药物发现的目的是通过激活或抑制细胞信号通路产生一种新的、有效的、高选择性的配体, 从而产生治疗反应。这需要一个适当的化验系统, 以测试铅化合物的可靠, 稳健和相关的结果1。药理技术, 如配体受体结合和功能检测往往采用异源细胞系统, 设计成过度受体, 否则将不存在2。虽然这些技术为受体药理学和早期药物开发提供了宝贵的洞察力, 但获得的数据可能并不反映真实的在体内情况。因此, 重要的是, 从细胞为基础的化验的药理数据也验证了生理学相关模型。
子宫平滑肌 (肌) 构成子宫的肌肉层, 这是负责的宫缩, 抹去和扩张宫颈和分娩胎儿3。肌的收缩是自发的;它不需要荷尔蒙或神经输入合同4。收缩是由自发去极化的层细胞膜, 导致开放电压操作的 ca2 +通道 (L 型通道) 和涌入的 ca2 +到单元格5。钙配合物, 并激活肌球蛋白轻链激酶, 反过来对肌球蛋白, 使跨桥循环形成与肌动蛋白和收缩。松弛通常介导的肌球蛋白磷酸化酶和减少浓度的 Ca2 +通过其挤压从细胞和/或螯合到肌网 (SR)5,6 ,7。
有几种方法研究层功能和功能障碍, 从体内内外 tocography 和宫内压力导管, 到层起源的转化或永生细胞的生成8 ,9,10,11,12。虽然细胞培养系统可以检测一种物质是否能在细胞水平上起作用, 但器官浴中的组织条可以被用作测量整个组织对药理试剂的功能反应的工具。传统的器官浴通常是一个大的加热玻璃室, 能够保持5和50毫升的生理盐水 (PSS)。在这些大的腔室通常需要曝气与氧气和大量的 PSS。在沐浴室内解剖并悬挂一条组织, 并附着在一个力传感器上, 测量张力的变化, 例如在收缩过程中。小条肌从人和动物包括, 豚鼠13, 老鼠14, 鼠15, 兔子16, 和其他17,18, 已被许多研究组使用, 以检查许多有关层生理和病理的问题, 包括早产和机能失调的劳动力。例如, 层条已被用来确定调节和修改肌源活动的因素19,20,21, 确定细胞功能, 如 SR22, 以及调查离子通道调制器23,24,25,26, 泵和交换器27 , 以确定它们在层生理学中的作用。
此ex 体内技术可用于评估组织收缩性能和不同药剂对收缩参数的直接影响, 包括收缩力 (强度)、频率和持续时间, 以及这些值的积分, 以生成一个总工作完成的指数 (平均积分力或曲线下的面积, 联合自卫队)。由于分离的组织切片的制备是一个以上的细胞类型的模型, 整个组织的生理反应可以测量。因此, 器官浴和分离的组织条是一个有用的工具, 提供桥梁之间的细胞培养工作和整个动物/在体内工作。因此, 在药物发现的领域, 新的代理人的影响, 其兴奋性 (即, 刺激) 或抑制 (即, 放松) 电位在体内可以得到更严密的评估。这项技术成功地用于发展的催产素-和 v1a-受体 (工程和 v1aR) 拮抗剂阿托西班作为一个宫缩的代理人, 以抑制早产和延缓早产。体外层条上的阿托西班检测发现拮抗剂能显著减少催产素 (OT) 的诱发收缩2829,30。重要的是, 这些研究有助于验证阿托西班的平移值, 并生成了用于临床试验所需的证据-概念数据31,32,33,34.在欧洲, 阿托西班现在被广泛用作延缓分娩的首选药物。类似的证据-概念研究进行了催产素模拟宫显示其治疗潜力, 以防止产后出血35,36,37。目前正在开发的其他铅化合物包括 retosiban (GSK221149A)38和 nolasiban (数据未发布)。这些方法也已成功地用于患者组之间的比较39、40、41、42、43、44、 45,46,47 , 并检查物种内部差异。
在这里, 我们描述了在小 (1 毫升) 定制的器官浴中使用孤立的前体组织条, 以说明如何使用这种方法来补充和验证从细胞基础的化验中获得的药理数据, 肌.活检主要是从妇女接受产前选择性剖宫产 (CS) 分娩, 因为他们是计划的手术, 因此更容易安排活检收集, 容易接触到肌, 组织将不会接触到任何在手术前宫缩兴奋剂或松弛。然而, 活检也可以从妇女接受无计划 (急诊) CS 分娩的分娩, 提供有足够的时间充分同意病人。大多数活检都是从手术切口部位的下子宫段手术中获得的, 但也可以从上段48,49中获取样本。在少数情况下阴道分娩后, 从胎盘床上的穿孔活检也获得了50。然而, 这不是最传统的路线和数量的层组织检索是小的。非怀孕肌可从绝经前或后更年期妇女进行子宫切除术, 以获得良性妇科疾病。全厚度活检取样后病理检查, 从较低的语料, 从子宫颈, 和肌是从子宫壁中间采取避免浆膜和子宫内膜表面。

<table><tbody><tr><td>Origin software</td><td>Origin Lab</td><td></td><td>2015 version</td></tr><tr><td>Labscribe Software</td><td>WPI</td><td></td><td>Formally Datatrax</td></tr><tr><td>GraphPad Prism graphical software</td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td>PRISM 5</td></tr><tr><td>LabTrax 4-Channel Data Acquisition</td><td>WPI</td><td>LAB-TRAX-4</td><td></td></tr><tr><td>Transbridge Transducer Amplifier</td><td>WPI</td><td>SYS-TBM4M</td><td></td></tr><tr><td>Force-displacement Transducer</td><td>WPI</td><td>FORT10g</td><td>10 g</td></tr><tr><td>BNC to BNC Cable</td><td>WPI</td><td>500184</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Clamp stand</td><td>WPI</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Micrometer</td><td>Reconditioned from microscopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Gilson</td><td>MINIPULS3</td><td>R4 Standard pump head</td></tr><tr><td>Suction pumps</td><td>Various</td><td>AP2 air pump</td><td></td></tr><tr><td>Circulating Water bath</td><td>Grant Instruments</td><td>TC120</td><td>5L</td></tr><tr><td>Perspex Tissue Bath</td><td>Custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water reservoir container</td><td>the reallyusefulbox</td><td></td><td>7L</td></tr><tr><td>Tissue Hooks (fixed)</td><td>Hand made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic tubing</td><td>Gilson</td><td>F117948</td><td>PVC 2.79 mm internal diameter</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>various diameters</td><td>R-3603</td></tr><tr><td>Aluminium clips</td><td>Laser services, USA</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Zoom binocular microscope</td><td>WPI</td><td>PZMIV</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Fiber-optic Light Source</td><td>WPI</td><td>PHOTONIC PL 2000</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Dishes</td><td>Handmade with Sylgard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Silicone Elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 170 Kit</td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>WPI</td><td>50086</td><td>8.5 cm, straight edge</td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>WPI</td><td>15914</td><td>10 cm, straight edge (serrated)</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>10 cm, straight</td></tr><tr><td>Dissecting pins</td><td>SIGMA</td><td>Z192341</td><td>B-D precision guide syringe needle 30G</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>SIGMA</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Physiological Salt Solution</td><td>SIGMA</td><td>various</td><td>PSS</td></tr><tr><td>Oxytocin acetate salt</td><td>SIGMA</td><td>O6379</td><td></td></tr><tr><td>[Arg8]-vasopressin acetate salt</td><td>SIGMA</td><td>V9879</td><td></td></tr></tbody></table>

contractility measurements of human uterine smooth muscle to aid drug development

新的药物化合物或生物化学探针的发现和表征依赖于强健和生理学相关的化验系统。我们描述的方法来测量前体内肌收缩力。这种方法可以用来研究影响层收缩调节的因素和分子, 并确定它们的兴奋或抑制行为, 因此它们的治疗电位在体内。经剖宫产分娩的妇女获得知情同意后进行活检。细条肌被解剖, 修剪和连接到一个力传感器在1毫升的器官浴 superfused 与生理盐水溶液在37° c。小条在2-3 小时内形成自发收缩在设定的紧张之下并且保持稳定在许多时间 (> 6 h)。条带也可以被刺激到合同例如由内源激素、催产素和抗利尿激素, 导致集中依赖性调节收缩频率、力量和持续时间, 到更加相似的收缩在分娩。因此, 已知和新的药物线索的影响可以测试自发和激动剂诱发的收缩。
本议定书具体详细说明如何通过测量其对人类层收缩的各种参数的影响来确定已知和新颖的制剂的效力。我们使用催产素-和 V1a受体拮抗剂, 阿托西班和 SR49059 作为已知的化合物的例子, 抑制催产素和加压激素诱发的收缩, 并演示如何使用此方法来补充和验证从细胞基础上获得的药理学数据, 以帮助药物开发。新的激动剂的作用与催产素和抗利尿激素的比较也可以描绘。虽然我们使用的例子催产素/抗利尿激素系统, 这个方法也可以用来研究其他受体和离子通道, 发挥作用, 在子宫收缩和松弛, 以促进了解人类的子宫生理和病理生理学。

利用这种模型, 可以对各种激动剂和收缩的拮抗剂以及已知或未知功能的新的反应物进行检测和量化。标准的药理参数, 如 EC50和 IC50值可以计算, 当试剂在广泛的浓度范围内使用,如, 10-510-9 M 和增加浓度沿对数刻度。
催产素受体拮抗剂浓度反应实验 在这个实验中, 对人类肌的配对条被切割如上所述, 并显示在图 1中, 安装在图 2中所描述的组织浴池中, 并允许平衡产生相等振幅的稳定收缩, 并频率.然后, 小条被暴露给内源性工程机械激动剂, OT (0.5 毫微米) 刺激收缩。在 OT (通常为45分钟) 下稳定活动一段时间后, 阿托西班被应用于一个带在增加的浓度沿对数刻度 (10-910-6 M)。第二条被留在 OT 单独作为时间控制。在图 5A中可以看到对阿托西班的响应的一个示例。以阿托西班第一浓度前的收缩为对照 (100%), 计算了每个浓度所应用的振幅和联合自卫队, 如图 4所示。对于时间控制实验, 测量了实验机动的时间当量。然后用图形软件包中的非线性回归函数 (图 5B-C) 对数据进行绘制和曲线拟合。在计算抑菌效果方面, 通过测量集成电路50的浓度, 计算了阿托西班的相对强度, 该值是引起半最大 (50%) 抑制反应的集中。对于激动剂或收缩的刺激也可以这样做。在这种情况下, 化合物的效力是从 EC50 (引起半最大刺激反应的浓度) 计算的。
新化合物的反应及其受体选择性检测 我们使用了这个生理学相关模型的前体人类层收缩, 以检测新合成的化合物的拮抗作用, [d-Arg8]-inotocin ([d-Arg8] INT) 的收缩刺激与本机 V1aR 激动剂, VP, 或本地工程机械的激动剂, OT。我们使用这种方法来验证 [d-Arg8] INT 的受体选择性, 它以前是由药理学的细胞法确定为 V1aR 的拮抗剂, 而不是在工程的54。
在这个实验中, 人类层带被暴露在 0.5 nm VP 或 0.5 nm OT 约1小时, 以刺激收缩, 如图 3所示, 在增加我们的新化合物 [d-Arg8] INT 在提高浓度 (图 6A和图6C). 这是然后与商业可用的, 已知的 V1aR 拮抗剂, SR49059 (图 6B)。图 6A说明了在 VP 刺激的人层收缩中, 浓度随 [d-Arg8] INT 浓度的增加而减少。在图 6Aii-iii中, 对每个浓度的收缩振幅和联合自卫队的数据进行了总结。其效果类似于在图 6Bi-iii中显示的已知 V1aR 抑制剂 SR49059 浓度的增加。(d-Arg8) int 对 V1aR 的选择性, 而不是对工程机械的选择, 这一事实证明, [d-Arg8] int 不减少人类层的收缩, 而这已被刺激与 OT (图 6C) 的振幅和联合自卫队保持稳定 (图 6Cii-iii)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig1.jpg"> 图 1: 人体层活检解剖.(a) 人体子宫图, 显示构成子宫壁的三组织层。最里层的层数是子宫内膜 (妊娠期蜕下, 红色箭头), 中层是肌 (肌肉层, 黑色箭头), 产生收缩, 最外层是 perimetrium (或浆膜膜, 蓝色箭头), 形成子宫周围有防护衣活检取样的感兴趣区域由黑色矩形描述。一个例子活检从怀孕妇女在剖宫产期间被显示在 (B) 与蜕膜和层层突出 (浆膜不可见)。重要的是, 不同的组织层的识别, 使肌的小条是正确的解剖试验。在 (C) 中显示了已解剖和修剪过的肌的示例条。通常, 2-6 条被剪切和修剪, 如图所示。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56639/56639fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig2.jpg"> 图 2: 用于测量人体肌收缩的多器官浴实验.(A) 带肌的小 (1 毫升) 的器官浴室放置在一个加热的水库顶部 (i), 并通过蠕动泵 (ii) 的方式 superfused 生理盐水溶液 (PSS)。该油藏通过循环水浴 (iii.) 在设定的温度下维持。每一条都附着在一个力传感器 (iv) 上, 它记录了收缩过程中的张力变化。这是放大的 transbridge 放大器 (v), 并转换成数字信号 (vi), 这是记录在计算机系统 (vii) 运行相关的采集软件。(B) 一个器官浴室的放大图像, 带有一条人类肌的原位(红色箭头), 在 PSS 中沐浴, 一端附着在力传感器上, 另一个连接到固定钩。(C) 设置的示意图概述。填充有 pss 的组织室在37° c 下, 通过热交换与热水池 (保持在45° c) 和循环水泵设置在55° c 的温度下, 持续地灌注。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56639/56639fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig3.jpg"> 图 3:体外自发和激动剂刺激的人肌的收缩.在无激动剂的条件下, 自发收缩保持稳定超过3小时的记录, 没有明显的振幅损失或区域下的曲线 (联合自卫队) (全部, Aiii), 证明该模型的鲁棒性, 以调查各种药物在自发性收缩中的应用。在建立稳定, 自发收缩后, 0.5 nM 催产素 (B, OT) 或抗利尿激素 (C, VP) 被添加到生理盐水溶液 (PSS)。刺激下的收缩也保持稳定的几个小时, 而没有明显的收缩振幅损失 (Bii, Cii) 或联合自卫队 (比尔, Ciii), 使各种收缩剂的效果是在层激动剂存在的情况下进行调查。数据被显示为平均±标准误差 (SEM)。注意, 对于激动剂刺激的收缩 (B, C), 控制期 (100%) 是在前45分钟的激动剂应用后采取的, 一旦宫缩稳定下来。在所有情况下, 带 superfused 与 PSS 在37° c, pH 7.4 (转载自阿罗史密斯et al.40具有生殖科学和 Di 季略et al.的权限54 , 具有在 "创造性通用开放访问许可证" 下的科学报告权限)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56639/56639fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig4.jpg"> 图 4: 数据分析(A)以红色显示的适当控制期是通过在测试化合物 (药物 X) 的应用前立即选择收缩来确定的. 这个控制期也同样在时间上应用药物 X (例如, 在本例中为), 40 分钟).测量控制周期的值被设置为100%。随后所有的测量都以控制的百分比表示。(B) 有4不同的收缩参数可以测量: (一) 收缩强度 (力, 锰), (ii) 收缩频率, 测量收缩率, (iii) 收缩时间这是测量在半最大峰值收缩, 和 (iv) 面积在曲线 (也称为力积分, 任意单位), 这给了衡量整体工作做。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56639/56639fig4large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig5.jpg"> 图 5: 记录阿托西班对人肌催产素引起的收缩的拮抗作用.一旦自发收缩建立, 宫缩刺激与催产素受体激动剂, 催产素 (OT)。收缩被允许稳定在刺激之下进一步 45 min. (a) V1a和 OT 受体拮抗剂, 阿托西班然后应用在增加浓度沿对数刻度 (10-9-10-5M)。在阿托西班第一浓度前的期间的收缩被测量并且采取作为控制 (100%)。在每个后续浓度下的活动被测量, 并表示为控制的百分比。同样的是执行的小条暴露于 OT 单独使用的时间当量的实验演习。数据在图形软件中绘制: (B, C) 显示阿托西班 (蓝色) 的拮抗作用的浓度-反应曲线和车辆的适当稀释 (灰色、时间控制) 对 OT 诱发的层收缩振幅和区域在曲线之下 (联合自卫队), 分别。数据显示为平均±标准误差的平均值 (SEM) 百分比的幅度和联合自卫队的控制活动 (在应用阿托西班)。然后计算 IC50的值, 使其浓度达到了收缩和力积分 (联合自卫队) 振幅的半最大抑制 (50%) 响应 (从阿罗史密斯et al.中复制。40具有生殖科学的权限)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56639/56639fig5large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56639/56639fig6.jpg"> 图 6: 测试一种新型化合物对人层收缩的影响和受体选择性.在人的肌的自发收缩建立了之后, 收缩被刺激了与加压素受体激动剂, 抗利尿激素 (VP) (Ai, Bi) 或催产素感受器官激动素 (OT) (Ci)。[d-Arg8]-inotocin ([d-Arg8] INT) 和商业上可用的 V1aR 拮抗剂, SR49059 在 VP 刺激的收缩作用下, 通过应用增加的化合物浓度来评估。典型的响应显示在 (Ai, Bi) 中。相关的分析数据的振幅和面积曲线 (联合自卫队) 显示在 (ii) 和 (iii), 分别在效果表示为控制活动的百分比 (100%)。两个 [d-Arg8] int 和已知的 V1ar 拮抗剂, SR49059 导致剂量依赖性下降的幅度和联合自卫队, 支持的作用 [d-Arg8] int 作为一个 V1ar 受体拮抗剂在人类肌。相比之下, [d-Arg8] int 不影响 OT 刺激的宫缩 (Ci iii), 因此类似于我们的研究结果从细胞基础的检测, [d-Arg8] int 也显示对 V1aR 在人类肌中的选择性 (从 Di 复制的数据季略et al.54 , 具有在 "创造性通用开放访问许可证" 下的科学报告权限)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56639/56639fig6large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>

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Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

人子宫平滑肌的收缩力测量对药物开发的帮助

本文介绍了研究人类肌的活体收缩的实验方案及其在药物发现中的应用.这项技术是用来提高对层生理学和病理生理学的理解, 以及验证药理数据从新的研究探针或药物的线索。

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

contractility-measurements-human-uterine-smooth-muscle-to-aid-drug

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K 次观看.  University of Liverpool. 本文介绍了研究人类肌的活体收缩的实验方案及其在药物发现中的应用.这项技术是用来提高对层生理学和病理生理学的理解, 以及验证药理数据从新的研究探针或药物的线索。

视频: Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

在犬体内的肌肉功能测定

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

科研

医学

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

膀胱平滑肌收缩带作为一种方法来评估下尿路药理学

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, function at both the cellular and tissue levels,and regulate the mechanical systems in the body. Numerous biological processes are force-dependent, including motility, adhesion, and division of single-cells, as well as contraction and relaxation of organs such as the heart, bladder, lungs, intestines, and uterus. Given its importance in maintaining proper physiological function, cellular contractility can also drive disease processes when exaggerated or disrupted. Asthma, hypertension, preterm labor, fibrotic scarring, and underactive bladder are all examples of mechanically driven disease processes that could potentially be alleviated with proper control of cellular contractile force. Here, we present a comprehensive protocol for utilizing a novel microplate-based contractility assay technology known as fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS), that provides simplified and intuitive analysis of single-cell contractility in a massively scaled manner. Herein, we provide a step-wise protocol for obtaining two six-point dose-response curves describing the effects of two contractile inhibitors on the contraction of primary human bladder smooth muscle cells in a simple procedure utilizing just a single FLECS assay microplate, to demonstrate proper technique to users of the method. Using FLECS Technology, all researchers with basic biological laboratories and fluorescent microscopy systems gain access to studying this fundamental but difficult-to-quantify functional cell phenotype, effectively lowering the entry barrier into the field of force biology and phenotypic screening of contractile cell force.

This work presents a flexible protocol for utilizing fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS) Technology in microwell format for simplified, hands-off quantification of single-cell contractile forces based on visualized displacements of fluorescent protein micropatterns.

使用微图案弹性体对单细胞收缩力进行简化的高通量分析

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

生物工程

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

用线 Myography 测定小鼠肠系膜动脉的等轴收缩力

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

平滑肌功能中分离出来的组织浴，应用药理学研究测量

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

生物学

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

对离体乳头肌的心脏收缩力对小鼠的研究收缩尺寸

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Measurement of Heart Contractility in Isolated Adult Human Primary Cardiomyocytes

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This paper describes a protocol for assessing changes in contractility in adult human primary ventricular cardiomyocytes utilizing the MyoBLAZER, a non-invasive optical method that preserves the normal physiology and pharmacology of the cells. This optical recording method continuously measures contractility transients from multiple cells in parallel, providing both medium-throughput and valuable information for each individual cell in the field of view, enabling the real-time tracking of drug effects. The cardiomyocyte contractions are induced by paced electrical field stimulation, and the acquired bright field images are fed to an image-processing software that measures the sarcomere shortening across multiple cardiomyocytes. This method rapidly generates different endpoints related to the kinetics of contraction and relaxation phases, and the resulting data can then be interpreted in relation to different concentrations of a test article. This method is also employed in the late stages of preclinical development to perform follow-up mechanistic studies to support ongoing clinical studies. Thus, the adult human primary cardiomyocyte-based model combined with the optical system for continuous contractility monitoring has the potential to contribute to a new era of in vitro cardiac data translatability in preclinical medical therapy development.

This protocol describes how to measure contractility in adult human primary cardiomyocytes from donor hearts with the MyoBLAZER system, a reliable platform for assessing drug-induced changes in contractility during preclinical development.

分离的成人原代心肌细胞心脏收缩力的测量

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. Here, we present an easy and inexpensive method that would be instrumental for testing new drugs decreasing uterine contractility. This method utilizes the unique ability of the entire mouse reproductive tract to exhibit spontaneous motility when maintained ex vivo in a Petri dish containing oxygenated Krebs buffer. This spontaneous motility resembles the wave-like myometrial activity of the human uterus, referred to as endometrial waves. To demonstrate the effectiveness of the method, we employed a well-known uterine relaxant drug, epinephrine. We demonstrate that the spontaneous motility of the entire mouse reproductive tract can be quickly and reversibly inhibited by 1 &#181;M epinephrine in this Petri dish model. Documenting the changes of uterine motility can be easily done using an ordinary smart phone or a sophisticated digital camera. We developed a MATLAB-based algorithm allowing motion tracking to quantify spontaneous uterine motility changes by measuring the rate of uterine horn movements. A major advantage of this ex vivo approach is that the reproductive tract remains intact throughout the entire experiment, preserving all intrinsic intrauterine cellular interactions. The major limitation of this approach is that up to 10-20% of uteri may exhibit no spontaneous motility. Thus far, this is the first quantitative ex vivo method for assessing spontaneous uterine motility in a Petri dish model.

Uterine contractions are important for the well-being of females. However, pathologically increased contractility may result in dysmenorrhea, especially in younger females. Here, we describe a simple ex vivo preparation allowing quick assessment of the efficacy of smooth muscle relaxants that may be used for treating dysmenorrhea.

用于评估小鼠生殖道自发性的方法和用于数据分析的基于 MATLAB 的 Uterus 运动跟踪算法

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...

Measurement of Endothelium-Dependent Vasorelaxation in the Mouse Thoracic Aorta Using Tensometric Small Volume Chamber Myography

Small volume chamber tensometric myography is a commonly used technique to evaluate the vascular contractility of small and large blood vessels in laboratory animals and small arteries isolated from human tissue. The technique allows researchers to maintain isolated blood vessels in a tightly controlled and standardized (near-physiological) setting, with the option of adjusting to various environmental factors, while challenging the isolated vessels with different pharmacological agents that can induce vasoconstriction or vasodilation. The myograph chamber also provides a platform to measure vascular reactivity in response to various hormones, inhibitors, and agonists that may impact the function of smooth muscle and endothelial layers separately or simultaneously. The blood vessel wall is a complex structure consisting of three different layers: the intima (endothelial layer), media (smooth muscle and elastin fibers), and adventitia (collagen and other connective tissue). To gain a clear understanding of the functional properties of each layer, it is critical to have access to an experimental platform and system that would allow for a combinational approach to study all three layers simultaneously. Such an approach demands access to a semi-physiological condition that would mimic the in vivo environment in an ex vivo setting. Small volume chamber tensometric myography has provided an ideal environment to evaluate the impact of environmental cues, experimental variables, or pharmacological agonists and antagonists on vascular properties. For many years, scientists have used the tensometric myograph technique to measure endothelial function and smooth muscle contractility in response to different agents. In this report, a small volume chamber tensometric myograph system is used to measure endothelial function in the isolated mouse aorta. This report focuses on how small volume chamber tensometric myography can be used to evaluate the functional integrity of the endothelium in small segments of a large artery such as the thoracic aorta.

The present protocol describes the concepts and technical application of the tensometric myograph technique using a multi-chamber myograph system in the experimental ex vivo assessment of mouse aortic endothelial function.

使用张力测量小体积腔肌图测量小鼠胸主动脉内皮依赖性血管松弛

Small volume chamber tensometric myography is a commonly used technique to evaluate the vascular contractility of small and large blood vessels in ...

实时测量 hiPSC-CMs 中的钙和收缩力参数

Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) represent a powerful tool for studying mutation-mediated changes in cardiomyocyte function and defining the effects of stressors and drug interventions. In this study, it is demonstrated that this optics-based system is a powerful tool to assess the functional parameters of hiPSC-CMs in 2D. By using this platform, it is possible to perform paired measurements in a well-preserved temperature environment on different plate layouts. Moreover, this system provides researchers with instant data analysis.
This paper describes a method for measuring the contractility of unmodified hiPSC-CMs. Contraction kinetics are measured at 37 &#176;C based on pixel correlation changes relative to a reference frame taken at relaxation at a 250 Hz sampling frequency. Additionally, simultaneous measurements of intracellular calcium transients can be acquired by loading the cell with a calcium-sensitive fluorophore, such as Fura-2. Using a hyperswitch, ratiometric calcium measurements can be performed on a 50 &#181;m diameter illumination spot, corresponding to the area of the contractility measurements.

作者聚焦:实时测量人诱导多能干细胞来源的心肌细胞中的钙和收缩力参数  

Here, an established method is described to perform contractility and calcium measurements in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes using an optics-based platform. This platform enables researchers to study the effect of mutations and the response to various stimuli in a rapid and reproducible manner.

实时测量人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的钙和收缩力参数

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) represent a powerful tool for studying mutation-mediated changes in cardiomyocyte ...