作者感谢瑞典研究理事会，斯德哥尔摩郡议会和KI资金的支持。在卡罗林斯卡研究所/ SciLifeLab蛋白质科学研究平台基金（http://PSF.ki.se）进行MSP的表达和纯化。作者也想感谢帕西Purhonen博士和马蒂尔达·舍贝里博士分享他们的技术专长，并为他们及时的援助。

1.纳米圆盘的制备<ol><li>表达和膜支架蛋白8的纯化，35 <ol><li>表达在大肠杆菌 BL21的His-标记MSP1E3D1（DE3）中T1R pRARE2应变在烧瓶中。准备与在37℃下补充有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基的50mL过夜起始培养。稀释过夜起始培养在2L补充50微克/毫升卡那霉素了不起的肉汤培养基。 </li><li>生长的细胞在37℃，直至在600nm（OD 600）的光密度在18℃达到约3.诱导用0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）为3小时的蛋白的表达。 </li><li>制备裂解缓冲液（100mM的Tris-HCl，pH值8.0; 100毫摩尔NaCl; 10％甘油）。临用前加1毫米TCEP。 </li><li>在18℃诱导3小时后，收获，离心所述细胞10分钟，在4500 xg离心和4℃。弃去上清液，称重收获的细胞，并在裂解缓冲液以每克细胞的2裂解毫升缓冲液中的比例重新悬浮它们。 </li><li>裂解的细胞用脉冲超声处理（重复率:4秒开，4秒OFF）为3分钟，在80％的幅度。 </li><li>离心20分钟的裂解物在49000 xg离心和4℃。舍弃这个离心沉淀。 </li><li>注入上清液成5毫升镍+螯合柱连接到自动化液体色谱系统优选保持在4℃。 </li><li>洗脱步骤（步骤1.1.9）之前，洗涤用缓冲液1列 - 3的下方，以除去除了His-标记的MSP的所有蛋白质。监测280nm处跟随纯化过程中的蛋白质含量;在280处的UV记录应该每次洗涤后回到基线。 <ol><li>的40mM的Tris-HCl，300mM NaCl的10 mM咪唑，和1％的Triton，pH值8.0:用洗涤缓冲液1洗涤。 </li><li> 40毫米的Tris-HCl，300 MM:用洗涤液洗2的NaCl，20mM的咪唑，和50mM胆酸钠，pH值8.0。 </li><li>的40mM的Tris-HCl，300mM NaCl的，​​和50mM咪唑，pH 8.0的:用洗涤缓冲液3洗涤。 </li></ol></li><li>用40mM的Tris-HCl，300mM的NaCl和500mM咪唑，pH 8.0的洗脱MSP。 </li><li>改变缓冲器到MSP标准缓冲液（20mM的Tris-HCl，pH值7.5; 100毫摩尔NaCl;和0.5mM EDTA）中通过凝胶过滤8，35;每批产量应该在7毫克L -1。 </li></ol></li><li>磷脂原液的制备<ol><li>添加1-棕榈酰-2-油酰- SN溶于氯仿-glycero -3-磷酸胆碱（POPC）的305微升以25毫克/毫升到一个玻璃烧杯中的浓度，并通过用氮气缓流吹扫它蒸发氯仿。干燥在真空干燥器脂质过夜。注:执行该步骤以从脂质，留下脂质的薄膜在玻璃烧杯底部除去溶剂。</li><li>悬浮在通过涡旋管，直到溶液变得透明含有100mM胆酸钠的MSP标准缓冲器200微升脂质饼;这将提供具有50毫米的POPC浓度的溶液。 注意:一般来说，脂质洗涤剂此时的摩尔比应为1:2（脂:清洁剂）8。此脂质洗涤剂混合物可以储存在-80℃近2个月。 </li></ol></li><li>用于洗涤剂除去疏水珠粒制备<ol><li>代替5-克珠（干重），在50毫升的管中。 </li><li>用30ml 100％的甲醇洗珠，然后用40mL超纯水。 </li><li>与MSP毫升10标准缓冲液洗珠。最后，在4℃下用15ml的MSP标准缓冲的存储珠。 </li></ol></li><li>纳米圆盘重建<ol><li>免除MSP1E3D1（0.124毫米）的190微升到离心管中，加入的磷脂原液（50毫米毫米P 61.5微升OPC），以相同的管中。孵育在湿冰上重构混合物1小时。注意:此等于1的摩尔比:（:POPC MSP1E3D1）130。 </li><li>以0.5克每毫升珠粒重构混合物的浓度添加疏水珠以引发自组装过程。孵育在旋转恒温箱中在4℃下16小时。 </li><li>温育后，离心在13,000rpm XG 10分钟，4℃以除去沉淀物和聚集体。弃沉淀，并保存上清液。 </li><li>平衡的大小排阻层析柱（安装一个自动液相色谱系统上）与MSP标准缓冲液，直到在280nm处的吸光度是稳定的。注入上清液到柱并收集峰级分。 </li><li>测量的纳米圆盘的浓度在280nm处的峰的级分。使用MSP1E3D1（ε=29910厘米-1 M -1）的摩尔消光系数为纳米圆盘浓度的计算。注意:每纳米圆盘脂质的数量可以通过放射性标记的脂质和磷酸分析4的组合或单独磷酸盐分析来测定。 </li></ol></li></ol> 2.制备Monotopic蛋白5-脂氧合酶35 <ol><li>准备过夜起始培养。补充50毫升，100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基。接种用含有5-脂氧化酶基因（ALOX5）的质粒的大肠杆菌 BL21（DE3）中的介质。稀释过夜起始培养在含有42毫摩尔的 Na 2 HPO 4，24毫KH 2 PO 4，9毫摩尔NaCl，19毫摩尔氯化铵 ，1mM的MgSO 4上，0.1毫氯化钙 ，0.2％D-葡萄糖，0.1表达培养基％，5微米的FeSO 4，和100微克/ mL氨苄青霉素。生长细胞直到OD 600为〜0.5，在25℃。在20℃35诱导蛋白表达用0.2mM的IPTG 16小时。 </li><li>收获离心在7000 xg离心和4℃10分钟并弃去上清液。称重在含有裂解缓冲液收获细胞，重悬收集的细胞在管的底部的沉淀含有蛋白酶抑制剂和0.5（100毫摩尔Tris-HCL，pH8.0中;和1mM TCEP 100mM NaCl的; 10％甘油）中毫克/毫升35溶菌酶以2mL每克细胞的裂解缓冲液的比例。 </li><li>裂解在80％振幅的细胞通过超声处理5×15秒。离心10分钟在7000 XG，4℃取出细胞碎片。执行硫酸铵沉淀到30 - 60％的饱和溶液中的35，以沉淀蛋白质。离心16,000 xg离心15分钟，4℃。注:5LO粒料可以快速冷冻并储存在-80℃下长达6个月。 </li><li>悬浮用20ml裂解缓冲液和离心分离的沉淀物为以40,000 xg离心15分钟，4℃。 </li><li>孵育上清<html>在4℃下进行的ATP琼脂糖柱30分钟。用含有0.5M NaCl的裂解缓冲液中的一列体积洗柱一次。洗脱用20mM ATP的5LO在含有10μM的FeSO 4和20微克/毫升过氧化氢酶的裂解缓冲液。执行凝胶过滤层析以除去ATP的35。 注:5LO是不稳定的，应在纯化后立即使用。否则，推荐在硫酸铵沉淀的步骤（见步骤2.1.3后音符）停止。 </li></ol> 3.纳米圆盘蛋白复合物的制备<ol><li>制备100μL的复合物的总体积。拌0.8μMND和0.8μM的5LO与1毫米的Ca 2+存在于MSP标准缓冲液（20mM的Tris-HCl，pH值7.5; 100毫摩尔NaCl; 0.5mM EDTA的;和1.5mM的氯化钙2）和孵育10分钟在冰上。注:样品可以储存在4℃下35至一个月。 </li></ol>样品的ove_title"&gt; 4。分析<ol><li>凝胶电泳<ol><li>非变性电泳<ol><li>混合使用装载缓冲液的5微升（50毫BisTris，6当量盐酸，50 mM氯化钠，10％（重量/体积）甘油，和0.001％丽春红，pH值7.2）49样品15微升并加载在4 - 16％双Tris凝胶电泳执行。 </li><li>填充光阴极缓冲阴极罐（50毫双的Tris; 50mM的曲辛，pH值6.8;以及0.002％考马斯G-250），并与运行缓冲液（50mM二的Tris和50mM麦黄酮，PH值6.8）在阳极罐。在150 V.使用恒定电压开始分离</li><li>停止电泳分离时考马斯前沿到达凝胶的末端。 </li><li>染色用标准考马斯蓝协议的凝胶。 </li></ol></li><li>变性电泳<ol><li>混合样品40微升用含SDS上样缓冲液10微升（0.05％（重量/体积）溴酚蓝;的0.2M的Tris-HCl，pH值6.8; 20％（体积/体积）甘油; 10％（重量/体积）SDS中和10mM 2-巯基乙醇），并加载在4 - 20％的Tris甘氨酸凝胶进行电泳。 </li><li>用运行缓冲液填充在阴极和阳极罐（25毫摩尔Tris盐酸，pH值6.8; 200毫甘氨酸;及0.1％（重量/体积）SDS）。在150 V.使用恒定电压开始分离</li><li>停止电泳分离时装载染料前沿到达凝胶的末端。 </li><li>染色用标准考马斯蓝协议的凝胶。 </li></ol></li></ol></li><li>的NAPT溶液的制备<ol><li>溶解1g盐磷钨酸钠在50毫升水通过搅拌在室温下，得到2％（重量/体积）的酸性溶液。 </li><li>将pH调节至7.4，用1M的NaOH。使用0.22微米的注射器过滤器除去颗粒。储存在室温下或4℃的溶液中。 </li></ol></li><li>样品的TEM分析的制备<ol><li>辉光放电碳包覆铜网格（400目）为20秒，在30 mA到呈现样品的吸附前亲水的网格。放置在网格上的样品（0.8μM相对于所述纳米圆盘）的3.5微升并孵育30秒。注:施加的体积可以变化微升2.5和5之间，这取决于样品浓度。对于纳米圆盘合适的浓度范围为0.5 - 1微米。 </li><li>用滤纸吸干多余的解决方案。 </li><li>立即染色用2％NAPT的30秒的下降电网。吸去多余的溶液，并离开网格风干。 </li><li>评估通过TEM网格。与120-200千电子伏加速电压显微镜足以估计堆积的程度。注:在本协议中，使用了校准的透射电子显微镜，配备了一枚200千电子伏场发射枪。 </li><li>记录TEM图像。对于呈现多头堆栈的图像，不进一步处理;图像显示的纳米圆盘的复合物，与外在蛋白可能包含几短栈，但大多数颗粒是在复杂的。记录多个图像和过程中，这些根据标准方法来获得类的平均值和低分辨率，复杂的三维模型。 注:对于负染色数据的收集，网格被至少在三个不同的日子进行。每一天，涂敷负染色前新鲜样品孵育（如在步骤3.1）中进行。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

该方法可以被分为三个部分:空纳米圆盘的重组，制备蛋白质 - 纳米圆盘复合物，以及用于这些配合物的TEM的阴性染色。每个部分将分别关于该技术，关键步骤，和有用的改进的局限性来解决。 空纳米圆盘重建。关键步骤和限制在生产和使用纳米圆盘。 为空的纳米圆盘的制备中，有必要优化MSP与脂质的比例。对于最常见的MSP和脂质（使用胆作为洗涤剂），为最佳比率建议可以在文献中找到（ 例如，125 -每MSP1E3D1 8，51 130 POPC在本协议中使用）。差异获得的相比已发布比率可取决于用于蛋白质浓度测定，升效率的方法IPID溶剂化在洗涤剂，并从溶液中去除清洁剂的方法。 我们提出使用疏水珠48（步骤1.3）来执行的洗涤剂除去，而可能的替代方案是透析或添加环糊精52,53。最初，用透析的HDL 5，34的重组和仍优选54。无论洗涤剂除去方法的，速度是必不可少的。如果去除太快（疏水珠的体积过大），MSP与脂质的自发重排可能没有发生时间。相反，大量脂质体和蛋白质聚集体可以形成。从大小排阻层析的结果将显示大量脂质体中的空隙体积，再生的纳米圆盘的次优峰，和未使用较大的峰MSP 4，6，51。为疏水性珠过小的体积，所述洗涤剂除去可能是不完整的，并且，形成了纳米圆盘可能显示的尺寸，其中大多数是小于预期的变化。一个可以测试的疏水珠而不是一个大除了较小体积的两个加法到重建的速度慢下来。 脂质的选择应慎重考虑8，9，45，46，55，视宗旨，为纳米圆盘准备。在一般情况下，对于针对膜的形成（纳米圆盘或脂质体的重建，以及用于二维结晶实验）的所有方法，脂类必须处于"流体"状态56。低于一定温度时，第Ë脂质是刚性的。上述这种所谓的过渡温度（Tm），所述脂质是流体。请注意，某些常用的饱和脂质具有的Tm高于室温。此外，脂质混合物，脂质MUSE的混溶性被认为是57。对于纳米圆盘形成的最佳温度是周围的类脂的相变（Tm）的。 在本协议中的洗涤剂胆酸钠8。如果必须使用另一种洗涤剂，不能直接使用相同的浓度与用于胆。某些温和洗涤剂溶解脂质效率较低，并可能需要更高的浓度。将氯仿（步骤1.2.2在协议）的蒸发之后获得的脂质饼必须溶解到由洗涤剂澄清溶液。涡旋，冻融循环，超声浴，或超声处理可以用来加速溶解。 对于combinat脂质的离子（-mixtures），MSP，和比这里使用的，滴定以减少大的聚集体和脂质体或过量的MSP其它洗涤剂是必要4，6，51，58。对于MSP和磷脂的一些组合，最优化可能比其他4，6，51更加困难，并且它成为必要，以确定峰值级分的含量。对于纳米圆盘组成和尺寸的分析的最精确的方法是通过磷酸盐分析4确定每MSP磷脂的数量，并计算出纳米圆盘分子量。纳米圆盘大小可通过公解决，非变性凝胶电泳来估计动态光散射（DLS）59;或负染色TEM，仅举几个方法。作为用于反齿刃略去染色诱导堆叠协议提出这里，存在于TEM图像的叠层的宽度的测量得到的纳米圆盘的直径。 至于膜支架蛋白的表达和纯化，对可溶性蛋白的所有通常的预防措施和关切，应采取。可用可包含不同的标记和蛋白酶切割位点的质粒的情况下，该标记必须使用MSP之前被移除。 5LO，在协议中使用的monotopic蛋白，灭活除非迅速采取预防措施，35别处描述和其中的参考文献。简言之，在催化铁容易丢失，并在氧化条件可能导致5LO的二聚化。正如说明（协议步2.1.3）指出的那样，可以净化沉淀步骤，并存储到以后使用等分后停止。等分试样的纯化后，蛋白质必须在几个小时ð内使用<html> UE的快速失活35。 在蛋白质 - 纳米圆盘络合物的制备关键步骤。 所述monotopic蛋白相对于纳米圆盘面积的大小是重要的。所述MSP1E3D1蛋白链的长度对应于纳米圆盘与10.5纳米内径和大约8900埃2的双层区域8。这对应很好地报道5LO 45的膜嵌入部分的区域。因此，我们的预期的结合比为1:1，或者至多2:1每纳米圆盘5LO。这被证明是正确的，因为在滴定实验35报道。但是，没有获得的最大两个5LO每个纳米圆盘结合，其他地方35所讨论。稍大纳米圆盘可能可能允许一个完整的2:实验中，这是可取的1结合，但在这种情况下，1:1的比例是主要目的。 ove_content"&gt;蛋白质-纳米圆盘复合物形成最佳的脂质的选择可以由以前的知识来辅助，这是在本协议，其中脂质的选择是合成POPC 35的情况下的脂质头部基团46和变化都变在酰基链45的饱和在脂质体5LO结合研究进行了测试。5LO活性增加由含有的sn-2酰基链位置45，46是不饱和的胆碱的磷脂脂质体的结合，如果特定脂质要求尚不清楚，但原始膜的身份是已知的，天然的脂质提取物，可以测试前55。 辅因子依赖性闻名5LO，它依赖于钙离子的膜结合43。它是具有挑战性的解决方案，从完全去除钙。此处，络合剂EDTA的存在调整，以保留自由的Ca 2+离子的受控量的量的缓冲液。在缓冲器游离和结合分子的计算是由BAD 60软件对含有多于一种类型的络合剂35的缓冲器制成。上部分溶解在膜辅因子的浓度的效果不受此软件占。 在纳米圆盘负染的关键步骤，以促进形成堆栈。 手头的协议，其中，最大的堆叠是期望的，污渍应phosphotungsten的钠盐。钨的不同的盐是可用的，并且我们观察到，磷钨酸是在堆叠效率较低（未示出）。原因不明，似乎高量的PT染色过程中钠的促进堆叠。另外，对于样品缓冲液，它表明，在cont钠下部耳鼻喉科，诱导堆垛32的量越低。出于同样的原因，样品之后已经被应用到在EM电网，染色前用水洗涤不应该执行，因为这也减少了堆叠。另一方面，一些堆叠总是诱导，虽然从未到所需的协议的最佳性能的程度。 当然，像在这里的Ca 2+离子辅因子必须检查干扰与阴性染色或与纳米圆盘。对于本协议，钙离子会沉淀出的磷酸盐缓冲液，所以使用Tris缓冲液。纳米圆盘不是由钙离子本身层叠，作为使用另一个负染色，铀酸盐35检查，也没有钙防止NAPT诱导堆垛（ 图3B）。 对于一个小monotopic蛋白，通过结合到纳米圆盘可能使其在cryoEM检测添加的额外尺寸。一个非常大的纳米圆盘相比，蛋白质可能不是最佳的，因为在大纳米圆盘不能防止堆叠的小蛋白质。然而，外在蛋白的形状可以有一个影响。尽管没有确切的比率可以作为现在将提供，推荐使用纳米圆盘双层表面仅比蛋白的估计的结合表面略大。与此限制，最大蛋白结合将是对纳米圆盘的每一侧一种蛋白质。 常规限制，并且该方法的优点。 该协议取决于一个TEM及相关设备，这是不是在所有实验室提供的可用性。然而，配备有传统的CCD照相机一个120-到200千伏电子显微镜将用于检测堆叠的就足够了。的NAPT负染色在室温下进行，并且该网格可以存储在此温度下供以后观看。 透射电镜IMAGING将很快显示出堆叠是否已阻止与否。为表示蛋白纳米圆盘复合物（ 例如， 图4A和B），进一步处理，以获得结构信息的图像可以进行。负染色的样品的结构细节可达到1nm且可提供有用的结构信息29。在致力于通过cryoEM到结构测定实验室，样品染色阴性的标准程序。使用我们的协议将是一个快速和简单的除了常规的程序。 一些monotopic蛋白锚定到由肉豆蔻酰化，棕榈酰化，或在蛋白质表面上的疏水补丁的膜，因此有必要以形成由相同的程序作为用于跨膜蛋白掺入纳米圆盘13纳米圆盘-蛋白质复合物。在这里，在所述蛋白复合物的亚基之一含有上午yristoylation一个灵活的N端尾巴膜结合。为乙酸双氧铀染色TEM图像，有人指出，该蛋白质复合体垂直结合于膜，而不是在纳米圆盘的一侧。这个和其他结果证实了该膜附着13的刚性结构。对于这种绑定，NAPT根据我们提出的协议将表现出同样的均匀分布的单颗粒染色。但是，如果该附件已经经由柔性链是，该醋酸铀染色可能没有给出明确的结果。我们推测，对于柔性链膜附着蛋白复合物，所述NAPT染色可诱导纳米圆盘堆叠，展示了典型的"硬币堆"，但现在由上侧面的附着蛋白装饰。 为什么要使用的纳米圆盘，如果可以用脂质体？脂质，辅助因子，或其它参数的优化很可能在脂质体中被测试为每的结合ipheral蛋白（ 比照 5LO）。脂质体的NAPT诱导堆叠已经证明32，所以一个monotopic蛋白能够防止脂质体的堆叠。然而，脂质体相比尺寸为monotopic蛋白质和纳米圆盘中也发挥了作用。大量外源性蛋白也许能防止脂质体的堆积，而小蛋白，如78 kDa的5LO，可能不存在，除非每脂质体高的数字。小脂质体可制备，但其膜的囊泡越小，更强的曲率。纳米圆盘双层是平的。测试使用纳米圆盘各种参数可以是具有成本效益的较少由于在MSP。另一方面，对于脂质体，某些昂贵辅因子或基底部分地分隔成该膜，并进一步，进脂质体的内部，可以在较大的量必需的。总之，纳米圆盘平台提供选择一个定义的区域用于结合一个精确n的可能性<html>蛋白质的红棕色。双层面积是从两侧的并且是平坦的。 该方法的意义。 确定蛋白质或复合物大分子的三维结构可视化的细胞的内部工作。在这种拥挤的环境，特定蛋白是对膜表面上，单独或与其它蛋白复合物，但通常使用的组件中的脂双层的物理相互作用是其机械功能的一部分活性。对于一些蛋白质，在溶液中的构象时膜嵌入由于某种触发的改变，而其他被拴到膜但尽管如此改变在膜构或取向。然后疏水基底进入路径可能会打开，或者可能会发生构象允许绑定到一个跨膜蛋白。以获得的结构中，或结合到膜这样周蛋白的至少结构信息，是具有挑战性的。 jove_content"&gt;纳米圆盘在关于取向和功能上的膜10，11，12，13，14，15，16，17的一些研究中使用。细胞色素P450，在解毒中部，是由一个α螺旋锚定至膜，并包含血红素基团在其球状部分，允许线性二色性测量15，结果表明血红素的取向相对于在与由模拟接近一致的膜，从而加强从膜包埋细胞色素P450的模拟得出其它结论。为在一个小的纳米圆盘锚定于膜GTP酶，核磁共振研究可以识别两个不同的区域，用膜蛋白质上的接口的每个，并进一步，如何核蛋白<html>潮结合引起从一个界面切换到其他17个 。突变和效应的结合，以及GTP结合，在的Ras超家族发现了一些对活性的影响是依赖于在膜的取向，这会影响致癌信令16另一GTP酶进行了研究。 5LO具有可溶性构象61，并要求对钙的核膜43约束力。使用巨型单层脂质体，偏光，衰减，全反射红外线实验进行46。结果暗示，N-末端β桶结合膜，与从膜法线方向倾斜约45度的β桶的对称轴。的5LO C-末端结构域是近圆柱形α螺旋束，并且这提出了具有平行的长轴结合到膜45，="外部参照"&gt; 46。在嵌入纳米圆盘上5LO我们的早期工作，选择了双层的面积，以允许每一边一个5LO与上述建议的方向35。透射电镜照片证实了这一方向，虽然是在低分辨率35。如果，例如，只N-末端β桶被捆绑而不是C末端结构域，将已获得的更高数目每纳米圆盘5LO的。此外，另一种蛋白可以5LO，的膜结合和方向改变，例如活化剂，跨膜蛋白5-脂氧合酶激活蛋白，皮瓣。 FLAP被改组为纳米圆盘中，我们用TEM等方法来研究和5LO FLAP之间的相互作用。内源性花生四烯酸及其相互作用的结果被转换为白三烯A4，这是有效的化学引诱物的涉及许多炎性疾病41合成的第一步，42 </SUP&gt; 62。 的5LO-纳米圆盘复杂被计算为具有334 kDa的分子量，邻近约200 kDa的用于通过cryoEM结构调查极限。然而，正如5LO的原子结构是可用的61，其对接入中等分辨率，3维电子密度图将产生与所述纳米圆盘膜的交互信息。 在cryoEM技术的创新不仅推动分辨率原子级63也是推动大小限制较小的蛋白质。对于通过NMR 22结构测定，情况是相反的，因为其目的是增加尺寸范围，这是现在接近200 kDa的。近来，膜小GTP酶蛋白的结合通过NMR 16,17的影响。这些蛋白质只有约20 kDa的的，我们重新拴到7.6纳米的内径小的纳米圆盘中，形成约130 kDa的配合物。在未来，同样大小的复合物可以通过NMR和cryoEM进行调查，以阐明蛋白质膜结合的不同方面。 该协议的扩展可能是调查中含有纳米圆盘双层的跨膜蛋白（TMP）的纳米圆盘。在TMP-纳米圆盘NAPT诱导堆叠可以与含有相同的脂质组合物空纳米圆盘。大膜外循环将防止堆积，而短环路可能无法防止堆叠64。这也可以变成一个优点，因为该协议可以被用于研究蛋白质特异性结合的跨膜蛋白。 这种方法的优点在于膜的相互作用可以立即可视化。使大量空纳米圆盘的相对简单意味着人们可以扩展此方法筛选像pH，温度，缓冲液和monotopic蛋白结合的辅因子依赖性不同的条件。实际上，而纳米圆盘平台9为跨膜蛋白的稳定化开发的，越来越多地用于此目的，其为大量的更多或更少的瞬时结合外在蛋白的研究潜在存在于细胞内应明确保持心里。

在医学研究中，许多注意力集中在膜蛋白，无论是内在的或外在的，参与多种脂质的相互作用。与脂相互作用的蛋白质的工作包括任一选择的替代给脂质，如清洁剂，amphipols 1，或小蛋白质2，或发现的膜替代，保持该蛋白的可溶性和活性。硫辛酸膜替代品包括脂质体和纳米圆盘（ND）3,4。 纳米圆盘是通过改造蛋白的一部分，载脂蛋白A-1，高密度脂蛋白（HDL）在血液天然存在的开发近天然膜的平台。载脂蛋白A-1是243残留长的短的两亲性α螺旋链，并有一个免费的脂溶性构象。 在体外 ，当在脂质的存在下，蛋白质的ApoA-1的两个副本自发重新排列以环绕HYDR脂质双层补丁5 ophobic酰基链部。的ApoA-1的工程化的版本通常被称为膜支架蛋白（MSP），以及越来越多的是可商购的质粒或纯化的蛋白质。在6较长或较短的7膜支架蛋白重复或α螺旋的缺失载脂蛋白A-1的结果。这又使得能够形成大约6毫微米光盘7至17纳米的直径8英寸有不同类型的用于纳米圆盘3,9的应用程序。最常用的应用是提供一种完整的膜蛋白8的稳定的近天然膜的环境，预先3,9审查。 A-探索较少使用是为研究提供一个纳米膜表面外周膜蛋白10，11，12，13，14，15，16，17。下面的协议的部分1可视化制备的磷脂和膜支架蛋白组成的纳米圆盘的过程。 样品制备是在大多数方法的瓶颈。具体方法-样品可以添加特定的信息，但它们也使结果的比较困难。因此，它是简单的，当样品是多峰，并且可以在多种不同的方法可直接使用。与使用的纳米圆盘的一个优点是纳米圆盘的相比，脂质体（ 例如，样品可以直接用于两个TEM和非变性凝胶电泳，如在本协议）的小尺寸。 18。然而，嵌入脂质体膜中的monotopic膜蛋白没有高分辨率三维结构还没有公开发表，据我们所知。金纳米粒子或抗体可用于显现结合的蛋白质用TEM 19的脂质体或囊泡。尽管这些探针是非常具体的，它们可能是由光帷的膜结合位点或通过掩模的与柔性部件感兴趣的区域与膜结合蛋白干扰。金标记或抗体 - 复合的蛋白质也许可以在一个凝胶上分析，但是这将增加实验的成本。 虽然脂质体是一个很好的平台，我们不能肯定，流行ulation具有每脂质体蛋白质的特定的比率，可以通过使用纳米圆盘20的探索的特征。在脂质体，辅因子和底物可被截留在水溶性内部。这是膜水溶性物质将共享相同的命运两种膜的模拟物的。尽管如此，由于该双层区域是在纳米圆盘较小，需要物质的量较小以饱和纳米圆盘膜。 通过原子结构的测定蛋白质的认识功能的研究很多领域是必不可少。蛋白质结构测定方法包括X射线21;核磁共振（NMR）22，23;和透射电子显微镜（TEM）24在低温下，cryoEM。通过cryoEM分辨率近来有了很大的提高，主要是由于直接使用电子脱离的tectors 25,26。的大分子在近天然状态下拍摄的薄，玻璃体冰27。然而，由于生物分子的低对比度，它们变得很难在100的尺寸范围，以检测 - 200 kDa的。为适当大小的样品，数据收集可以制成并且可以应用于单粒子重建的方法，得到结构28。 然而，蛋白质结构的通过TEM测定是一个多步骤的过程。它通常与样品单分散性的使用负染色TEM 29像phosphotungsten（PT）30或铀31重金属盐的评估开始。的负染大分子的低分辨率模型的重构通常制成，并且可以得到在分子结构29的重要信息。在平行下，使用cryoEM可以开始收集数据。应谨慎评估负染色TEM数据时，为了避免假象形成的误解作出。一个特定的人工制品是在PT污点上的磷脂的效果和脂质体32，从而导致长棒类似，从侧面33观察硬币堆叠的形成。这种"ROULEAU"或"堆栈"（以下简称记为"堆"）观察早期对HDL 34，后来还为纳米圆盘中35。 膜的堆叠和重塑可能有很多原因发生。例如，它可以通过共因素，如铜，通过TEM成像钼酸铵染色36所示来诱导。膜脂质的脂质体的部分含有一个亚氨基二乙酸头组用EDTA模仿金属络合，从而在加入铜离子后堆叠脂质体<s补课="外部参照"&gt; 36。堆叠也可能是由于在或在脂质双层通过的蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用（使用的染色未提及）37。观察到初期由PT磷脂的叠层形成;然而，后来的工作重点是拆除或取消此神器形成38。 在这里，我们建议采取NAPT诱导纳米圆盘堆叠的膜结合蛋白的透射电镜研究优势的方法。总之，蛋白的纳米圆盘结合会阻止纳米圆盘从堆叠。虽然为堆叠的原因尚不清楚，有人提议39存在的磷脂和PT的磷酰基之间的静电相互作用，使光盘粘到彼此（ 图1A）。我们的协议背后的假设是，当一个蛋白结合至纳米圆盘，大部分磷脂表面的不availa<html>竹叶提取用于与PT中的相互作用由于由蛋白质空间位阻。这将防止堆的形成（ 图1B）。两个结论可以得出。首先，预防堆叠意味着感兴趣的蛋白质已结合到膜上。其次，蛋白质- ND复合体可以用标准的单粒子加工方法24，40被处理，以获得复合物的粗形态。此外，通过像非变性凝胶电泳或动态光散射方法的分析可以被执行。 为了证明这一假设，我们使用的膜结合蛋白5-脂氧合酶（5LO），其涉及许多炎性疾病41,42。这个78-kDa蛋白需要钙离子结合其膜43。虽然这种膜协会已被广泛研究使用脂质体S ="外部参照"&gt; 44，45,46和膜部分47，这些不能被用于TEM分析和结构确定。 纳米圆盘的制备通过混合脂重新悬浮于胆洗涤剂钠MSP开始。在冰上孵育1小时后，该洗涤剂慢慢地从使用吸附剂树脂重构混合物中除去。这种材料常常由聚苯乙烯形成小珠。他们是相对疏水并有较脂类结合48洗涤剂有强烈的偏好。除去疏水珠和使用离心进行澄清后，将纳米圆盘通过尺寸排阻色谱（SEC）纯化。纯化的纳米圆盘与以等摩尔比率（或几个比率滴定）一个monotopic膜蛋白（和可能的辅因子）混合，并留于rEACT（15分钟）。通过TEM分析是通过将样品的微升-量到辉光放电，碳包被的网格，然后通过与NAPT进行负染色进行。从当等分试样施加到TEM格栅上相同的样品可通过非变性或SDS-PAGE凝胶电泳，以及由各种活动的测量可用于分析，没有大的变化。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope: JEOL2100F</td>
			<td>JEOL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharger</td>
			<td>Baltec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grid: 400 mesh</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>GM016/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 HR 10/300</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid:MSP1E3D1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria: BL21DE3</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2</td>
			<td>Protein Science Facility, KI, Solna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purification Matrix: ATP agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid:POPC</td>
			<td>Avanti polar lipids</td>
			<td>850457C</td>
			<td>25 mg/ml in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm syringe filter: 0.2 &#956;m</td>
			<td>Pall life sciences</td>
			<td>PN 4554T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent: Sodium cholate hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6445-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholate</td>
			<td>500 mM Sodium cholate</td>
			<td></td>
			<td>Resuspend in miliQ water and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Stock</td>
			<td>50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#176;C for a week or 
			Store -80&#176;C for a month, after purging the solution with nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSP standard buffer</td>
			<td>20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer</td>
			<td>50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8</td>
			<td>BN2001</td>
			<td>Purchased from Thermofisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer</td>
			<td>50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250</td>
			<td>BN2002</td>
			<td>Purchased from Thermofisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer</td>
			<td>50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S</td>
			<td>BN2003</td>
			<td>Purchased from Thermofisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturaing Electrophoresis Running Buffer</td>
			<td>25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS</td>
			<td></td>
			<td>Inhouse receipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer</td>
			<td>0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>Inhouse receipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific broth</td>
			<td>Tryptone - 12.0g 
			Yeast Extract - 24.0g 
			100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4 
			Glycerol - 4 mL</td>
			<td></td>
			<td>Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method to visualize and analyze membrane interacting proteins by transmission electron microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

我们提出的方法，取决于制备纳米圆盘提供monotopic膜蛋白结合膜表面。因为有嵌入到纳米圆盘脂质双层无跨膜蛋白，所述纳米圆盘在这里表示为"空纳米圆盘"（ 图2A）。这些具有256 kDa的计算分子量两个MSP1E3D1骨架蛋白和大约260 POPC 8的分子的组合物。使用这种蛋白质:用于重建脂质比，一个主要的峰（ 图2A）的凝胶过滤中洗脱。约9毫升（ 图2A）的峰级分用蓝色天然凝胶电泳49检查，示出一个频带（ 图2B，泳道1）。虽然带对应于一个尺寸比计算256 kDa的略大一些，在TEM图像测量的纳米圆盘直径对应于预计13纳米±0.5纳米。 如前面35的上方（协议步骤2），并在更详细地描述纯化monotopic膜蛋白5-脂氧合酶（5LO）。 78 kDa的5LO的均匀性，通过SDS PAGE电泳（ 图2C，泳道1）分析和为35（未示出）充分发挥作用。 在这个协议中，条件是有意创建的促进纳米圆盘的堆叠。然而，应该指出的是，这种堆叠仅用于TEM成像（所谓的样品）制备的样品在诱导，特别是通过加入负染色钠磷钨作为已取得所有其它处理和补充后的最后一个步骤。事实上，NAPT染色的纳米圆盘的图像显示为高密度脂蛋白34的预期堆叠（ 图3A）很早</sUp&gt;和其他磷脂实体5，50。的（ 图3A）"从侧面观看硬币的长栈"，均与磷钨所述双层之间插聚集的纳米圆盘，如在图1A示意性地描述和张等人提出。 32，39。 检查各种添加在缓冲器是否影响，防止，或甚至诱导堆垛是很重要的，并且如将在下面变得显而易见，需要调查的钙离子的影响。在图3B中 ，堆叠仍然存在在钙离子加入到该纳米圆盘溶液与NAPT染色前的样品。 在该协议的基本步骤在图4中，其中该膜-仓中示出丁蛋白存在于所述的解决方案。堆叠不能由NAPT染色时5LO被结合到纳米圆盘（ 图4A）的膜面被诱导。对于该样品，5LO的向纳米圆盘的摩尔比为1:1，如在图1示意性示出（ 图1B，右下 ）。另外，作为纳米圆盘的脂质双层是从两侧接近，而相比之下，脂质体，标本与制备两种5LO一个纳米圆盘的比率，而TEM图像显示甚至更低的堆叠（ 图4B）。 结合，一些外在膜蛋白可以依赖于特定的脂质膜中的存在，如phosphoinositols 10，11，12或磷脂酰丝氨酸10。在5LO的情况下，钙离子的存在下是neces萨利43。在图4A和B中，钙离子存在于与纳米圆盘和5LO的解决方案。换言之，缺乏不仅堆叠表明monotopic蛋白已结合而且还结合依赖于钙离子。为了说明这一点，含有纳米圆盘和5LO但不含钙的溶液用NAPT染色并通过TEM（ 图4C）成像。正如预期的那样，5LO不能结合到纳米圆盘不含Ca 2+，留下5LO游离在溶液中，所以纳米圆盘堆叠代替（ 图4C）。 <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/55148/55148fig1.jpg" /> 图1.纳米圆盘堆叠和方法的概述的原则。 A.纳米圆盘堆叠的原则。加入负染色钠磷钨的至纳米圆盘（左）中的溶液导致为th<html> Ë堆叠纳米圆盘（右）由于磷脂双层和PT分子（中间，黑点）之间的静电力（中，箭头）。该协议的B.示意图。空纳米圆盘（左）结合到外在膜蛋白（灰色）以形成复合物，从四个不同角度（低级中间）描绘。所述monotopic蛋白的存在空间上防止了纳米圆盘从当与磷钨盐染色堆叠（右下），而相比之下，在没有任何大的对象（右上角）的诱导的堆叠。的绿光和橙色环代表围绕磷脂芯，这是在浅棕色表示的两种MSP包装。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55148/55148fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a> JPG"/&gt; 图2.纳米圆盘和5LO的同质分析。 A.尺寸重组空纳米圆盘排阻色谱法。纳米圆盘峰在9毫升洗脱。 B.非变性来自SEC（A）中所示的峰值部分的凝胶电泳分析。泳道M包含标记。单频段是目前在泳道1，凡在9毫升峰组分加载。 C.变性纯化5LO凝胶电泳分析。 78 kDa的5LO显示为1车道激烈乐队<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55148/55148fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a> <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/55148/55148fig3.jpg" /> 纳米圆盘中的蛋白质通过TEM分析缺席图3.堆叠形成。 A.纳米圆盘堆叠诱导W¯¯母鸡沾有NAPT。从侧面观察时，"硬币堆叠"是纳米圆盘的堆叠。每个纳米圆盘显示为白色带。当与NAPT染色B.堆叠不是由钙离子在纳米圆盘溶液中存在干扰。规模酒吧100纳米。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55148/55148fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a> <img alt="图4" src="/files/ftp_upload/55148/55148fig4.jpg" /> 图4.在用TEM分析的辅因子的存在下防止堆叠形成由结合蛋白。 A.和B.钙离子存在于与纳米圆盘5LO的混合物在1摩尔比:1（A）或2:1（B）中。越5LO结合到纳米圆盘，越少的纳米圆盘可用于堆叠，如图（B）中。在博单粒子复合第（A）和（B）是适合用于进一步处理35。 C.在缺乏钙离子，5LO不能结合。这个样本的NAPT染色显示纳米圆盘典型堆积，而使5LO绑定。规模酒吧100纳米。这些图像是由一个4K x 4K的CCD相机在69,500x的放大倍数收购。 CCD摄像机的像素尺寸为15μm，这给上为EM图像检体水平2.16埃的对应的值。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55148/55148fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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通过透射电子显微镜可视化和分析膜相互作用蛋白的方法生物化学|视频

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

方法可视化和用透射电子显微镜分析膜蛋白的相互作用

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

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A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

We have established a method for the purification of coregulatory interaction proteins using the LC-MS/MS system.

A蛋白制备方法在蛋白质与核余子交互使用LC-MS / MS分析的高通量鉴定

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

科研

生物化学

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

C2C12 Myotubes 测量反式等离子体膜电子传输

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and structure by spectrometry and scanning electron microscopy (SEM). A&#946;, which forms neurotoxic amyloid aggregates in Alzheimer&#39;s disease (AD), has been shown to interact with fibrinogen. This A&#946;-fibrinogen interaction makes the fibrin clot structurally abnormal and resistant to fibrinolysis. A&#946;-induced abnormalities in fibrin clotting may also contribute to cerebrovascular aspects of the AD pathology such as microinfarcts, inflammation, as well as, cerebral amyloid angiopathy (CAA). Given the potentially critical role of neurovascular deficits in AD pathology, developing compounds which can inhibit or lessen the A&#946;-fibrinogen interaction has promising therapeutic value. In vitro methods by which fibrin clot formation can be easily and systematically assessed are potentially useful tools for developing therapeutic compounds. Presented here is an optimized protocol for in vitro generation of the fibrin clot, as well as analysis of the effect of A&#946; and A&#946;-fibrinogen interaction inhibitors. The clot turbidity assay is rapid, highly reproducible and can be used to test multiple conditions simultaneously, allowing for the screening of large numbers of A&#946;-fibrinogen inhibitors. Hit compounds from this screening can be further evaluated for their ability to ameliorate A&#946;-induced structural abnormalities of the fibrin clot architecture using SEM. The effectiveness of these optimized protocols is demonstrated here using TDI-2760, a recently identified A&#946;-fibrinogen interaction inhibitor.

Presented here are two methods that can be used individually or in combination to analyze the effect of beta-amyloid on fibrin clot structure. Included is a protocol for creating an in vitro fibrin clot, followed by clot turbidity and scanning electron microscopy methods.

β-淀粉脂质诱导纤维蛋白斑点结构异常的光谱分析

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

线粒体和内质视网膜成像由相关光和体积电子显微镜

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal transduction, metabolism, and development. These metabolites perform this regulatory activity by binding to proteins, thereby changing protein conformation, catalytic activity, and/or interactions. The method described here uses affinity chromatography coupled to mass spectrometry or Western blotting to identify proteins that interact with inositol phosphates or phosphoinositides. Inositol phosphates or phosphoinositides are chemically tagged with biotin, which is then captured via streptavidin conjugated to agarose or magnetic beads. Proteins are isolated by their affinity of binding to the metabolite, then eluted and identified by mass spectrometry or Western blotting. The method has a simple workflow that is sensitive, non-radioactive, liposome-free, and customizable, supporting the analysis of protein and metabolite interaction with precision. This approach can be used in label-free or in amino acid-labelled quantitative mass spectrometry methods to identify protein-metabolite interactions in complex biological samples or using purified proteins. This protocol is optimized for the analysis of proteins from Trypanosoma brucei, but it can be adapted to related protozoan parasites, yeast or mammalian cells.

This protocol focuses on the identification of proteins that bind to inositol phosphates or phosphoinositides. It uses affinity chromatography with biotinylated inositol phosphates or phosphoinositides that are immobilized via streptavidin to agarose or magnetic beads. Inositol phosphate or phosphoinositide binding proteins are identified by Western blotting or mass spectrometry.

通过亲和色谱与西布洛特或质谱结合的亲致色谱,识别磷酸磷酸磷酸磷酸醇或磷酸蛋白

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

实时测量核苷酸与完整功能性膜蛋白的结合

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm phenotyping can be used to classify genotypes based on SG morphotype using scanning electron microscopic (SEM) analysis. SGs can be visualized using SEM by slicing through the kernel (pericarp, aleurone layers, and endosperm) and exposing the organellar contents. Current methods require the rice kernel to be embedded in plastic resin and sectioned using a microtome or embedded in a truncated pipette tip and sectioned by hand using a razor blade. The former method requires specialized equipment and is time-consuming, while the latter introduces a new host of problems depending on rice genotype. Chalky rice varieties, particularly, pose a problem for this type of sectioning due to the friable nature of their endosperm tissue. Presented here is a technique for preparing translucent and chalky rice kernel sections for microscopy, requiring only pipette tips and a scalpel blade. Preparing the sections within the confines of a pipette tip prevents rice kernel endosperm from shattering (for translucent or &#8216;vitreous&#8217; phenotypes) and crumbling (for chalky phenotypes). Using this technique, endosperm cell patterning and the structure of intact SGs can be observed.

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

This protocol allows for the preparation of transverse sections of cereal seeds (e.g., rice) for the analysis of endosperm and starch granule morphology using scanning electron microscopy.

成熟水稻的横向切片（米 苜蓿L.）使用移液器吸头作为固定支架的扫描电子显微镜成像的内核

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant bottleneck. Macromolecular samples are ideally imaged directly from random orientations in a thin layer of vitreous ice. However, many samples are refractory to this, and protein denaturation at the air-water interface is a common problem. To overcome such issues, support films-including amorphous carbon, graphene, and graphene oxide-can be applied to the grid to provide a surface which samples can populate, reducing the probability of particles experiencing the deleterious effects of the air-water interface. The application of these delicate supports to grids, however, requires careful handling to prevent breakage, airborne contamination, or extensive washing and cleaning steps. A recent report describes the development of an easy-to-use floatation block that facilitates wetted transfer of support films directly to the sample. Use of the block minimizes the number of manual handling steps required, preserving the physical integrity of the support film, and the time over which hydrophobic contamination can accrue, ensuring that a thin film of ice can still be generated. This paper provides step-by-step protocols for the preparation of carbon, graphene, and graphene oxide supports for EM studies.

Sample preparation for cryo-electron microscopy (cryo-EM) is a significant bottleneck in the structure determination workflow of this method. Here, we provide detailed methods for using an easy-to-use, three-dimensionally printed block for the preparation of support films to stabilize samples for transmission EM studies.

使用支撑浮块在透射电子显微镜中制备样品支撑膜

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The overall process involves i) vitrifying the specimen in a thin film supported on a cryoEM grid; ii) screening the specimen to assess particle distribution and ice quality; iii) if the grid is suitable, collecting a single particle dataset for analysis; and iv) image processing to yield an EM density map. In this protocol, an overview for each of these steps is provided, with a focus on the variables which a user can modify during the workflow and the troubleshooting of common issues. With remote microscope operation becoming standard in many facilities, variations on imaging protocols to assist users in efficient operation and imaging when physical access to the microscope is limited will be described.

Structure determination of macromolecular complexes using cryoEM has become routine for certain classes of proteins and complexes. Here, this pipeline is summarized (sample preparation, screening, data acquisition and processing) and readers are directed towards further detailed resources and variables that may be altered in the case of more challenging specimens.

单颗粒冷冻电子显微镜:从样品到结构

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules present in the cellular context and preserved in a near-native frozen-hydrated state. However, there are challenges associated with culturing and/or adhering cells onto TEM grids in a manner that is suitable for tomography while retaining the cells in their physiological state. Here, a detailed step-by-step protocol is presented on the use of micropatterning to direct and promote eukaryotic cell growth on TEM grids. During micropatterning, cell growth is directed by depositing extra-cellular matrix (ECM) proteins within specified patterns and positions on the foil of the TEM grid while the other areas remain coated with an anti-fouling layer. Flexibility in the choice of surface coating and pattern design makes micropatterning broadly applicable for a wide range of cell types. Micropatterning is useful for studies of structures within individual cells as well as more complex experimental systems such as host-pathogen interactions or differentiated multi-cellular communities. Micropatterning may also be integrated into many downstream whole-cell cryo-ET workflows, including correlative light and electron microscopy (cryo-CLEM) and focused-ion beam milling (cryo-FIB).

The goal of this protocol is to direct cell adhesion and growth to targeted areas of grids for cryo-electron microscopy. This is achieved by applying an anti-fouling layer that is ablated in user-specified patterns followed by deposition of extra-cellular matrix proteins in the patterned areas prior to cell seeding.

微图案透射电子显微镜网格，用于在全细胞冷冻电子断层扫描工作流程中指导细胞定位

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...