A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

في مختبرنا ، نركز على النوع النادر من أورام المخ والذي يسمى الأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة. غالبا ما تصيب هذه الأورام الدبقية الشباب ، وتتميز بطفرة في الجين المسمى IDH-1. التقدم الرئيسي في مجال الأورام الدبقية هو ، أولا ، استخدام نماذج ثلاثية الأبعاد ، مثل الورم أو العضية ، وثانيا ، استخدام التصوير مباشرة في دماغ الفئران المزروعة بالورم الدبقي ، وثالثا ، استخدام الحمض النووي الريبي النسخي الخاص وحيد الخلية.

التحدي الرئيسي الذي نواجهه عندما نعمل على الأورام الدبقية الطافرة IDH-1 هو انخفاض تكاثر هذه الخلايا وصعوبة الحفاظ عليها في الثقافة ، وحتى نكون قد اشتقنا ونحدد بروتوكولا للحفاظ على الخلايا على قيد الحياة ، وبالنسبة لبعضها ، تمكنا من اشتقاق خط خلوي ، ولكن ليس لجميع المرضى. من خلال دراسة الخلايا الطافرة IDH-1 في المختبر ، ولكن أيضا في الجسم الحي ، وجدنا أن هذه الخلايا بلاستيكية تماما ، ويمكن أن تتبنى خليتين ، إما أن تكون شبيهة بالخلايا النجمية أو تشبه البيضاوية ، ووجدنا أيضا أن الدفعة تلعب دورا رئيسيا في هذه اللدونة. باستخدام بروتوكول الزرع الجديد هذا ، تمكنا من الحفاظ على الخلايا الطافرة IDH-1 في المختبر لأسابيع ، ولكن أكثر من ذلك ، لعدة أشهر ، وقد أظهرنا أن هناك أنواعا مختلفة من الخلايا السرطانية ، كما وجدنا في المريض.

لقد وجدنا أيضا أن هناك بعض خلايا البيئة السرطانية ، مثل الخلايا الدبقية الصغيرة ، والتي تجعل من الممكن دراسة التفاعل بين الخلايا السرطانية وبيئتها ، لذلك تقدم هذه النماذج تمثيلا أكثر دقة للتنوع البيولوجي الموجود في الأورام. للبدء ، قم بإعداد مساحة العمل وترتيب جميع الأدوات المعقمة. انقل استئصال الورم إلى الجليد للحفاظ على صلاحية الأنسجة للثقافة.

فحص استئصال الورم للتأكد من حجمه وعدم تجانسه. حدد الأجزاء التي تعرض لونا رماديا مع نسيج ناعم أو يشبه الهلام ، لأن هذه المناطق غنية بالخلايا السرطانية. انقل عينات الورم المختارة إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مليلتر أو كريوفيال وأضف ملليلترا واحدا من الوسائط.

باستخدام مقص معقم ، قم بتقطيع العينات إلى قطع صغيرة بقياس واحد إلى ملليمترين مكعبين. بعد ذلك ، باستخدام مقص معقم ، قم بقص نهاية طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لإنشاء فتحة عريضة قطرها حوالي ثلاثة إلى أربعة ملليمترات. ماصة 100 إلى 200 ميكرولتر من شظايا الأنسجة المفرومة بطرف مقطوع في آبار اللوحة.

أعد تجانس التعليق برفق لضمان التوزيع المنتظم ، حيث تميل الأجزاء الأصغر إلى الاستقرار بسرعة. ضع الطبق في حاضنة على درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 100٪ رطوبة. استبدل الوسائط يوميا إذا تسبب النشاط الأيضي للورم في اصفرار سريع أو إذا كانت كثافة الشظايا تتطلب ذلك.

للبدء ، احصل على تعليق أنسجة الورم المفرومة. لتحضير وسط التجميد ، أضف ملليلترين من DMSO إلى ثمانية ملليلتر من وسط زراعة الخلايا. اجمع بين حجم واحد من معلق الورم المفروم مع حجم متساو من وسط التجميد DMSO المحضر بنسبة 20٪.

قم بعمل ماصة الخليط بعناية لأعلى ولأسفل لضمان الخلط الشامل. انقل المبردات بسرعة إلى حاوية مبردة لتسهيل التخفيض التدريجي لدرجة الحرارة ، ثم احتضانها طوال الليل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل نقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل. لإذابة الجليد ، قم بإزالة المبردات من النيتروجين السائل وضعها على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية.

قم بتسخينها حتى تذوب ما يقرب من 80٪ من الخلايا. لإزالة DMSO ، قم بنقل التعليق بسرعة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من 1X PBS الدافئ مسبقا وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 جم لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وكرر غسل PBS ، متبوعا بالطرد المركزي.

استنشق المادة الطافية ، مع ضمان بقاء الحبيبات دون إزعاج. أعد تعليق الحبيبات بكمية مناسبة من الوسط وانقلها إلى صفيحة PDL Laminin 24 بئر مطلية مسبقا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية.

لوحظ أن الخلايا التي تظهر مورفولوجيا ممدودة أو ثنائية القطب أو متعددة الأقطاب تنمو من إخلاضات الورم المرتبطة بسطح البئر بعد مدة زراعة لا تقل عن أربعة أسابيع. أظهرت الخلايا المشتقة من الورم مورفولوجيا مماثلة بين الأورام الطازجة والمحفوظة بالتبريد عبر ثلاث حالات ، كما يتضح من المظاهر الممدودة وثنائية القطب التي تشكل شبكات معقدة. لوحظ بوضوح الهجرة الشعاعية للخلية المشتقة من الورم على طول الألياف.

أظهرت مزارع الزرع غير الناجحة شظايا غير ملتصقة والعديد من الخلايا المزعجة ، التي تتميز بالتألق الذاتي ومحتوى الدهون.