سهلت أدوات تحرير الجينوم القائمة على كريسبر إلى حد كبير إنتاج نماذج المندوبين المعدلة وراثيا. يتكون نظام كريسبر من مركب RNA موجه واحد إلى نوكلياز Cas9 ويمكن برمجته لاستهداف سلسلة من الاهتمام داخل الجينوم لإنشاء كسر مزدوج للحمض النووي تقطعت به السبل. من خلال التسليم المشترك لقالب إصلاح الحمض النووي ، يمكن استعادة كسر الحمض النووي هذا بدقة جنبا إلى جنب مع إضافة أي تسلسل DNA هندسي مرغوب فيه من خلال عملية تسمى الإصلاح الموجه بالتماثل.
من خلال هذه العملية ، يمكننا إنشاء نماذج فئران غير مطروقة مع إدخال أو بدائل مستهدفة للحمض النووي. باستخدام هذا البروتوكول ، نقدم نهجا معدلا باستخدام الفيروس المرتبط بالغدي لتقديم قالب إصلاح الحمض النووي لأجنة الفئران ، إلى جانب التسليم اللاحق لمجمعات CRISPR Cas9 من خلال التثقيب الكهربائي للجنين المكون من خليتين. يتم حزم الأنماط المصلية AAV 1 أو 6 مع قالب إصلاح الحمض النووي المصمم ليتم دمجه في جينوم الفئران من خلال عملية الإصلاح الموجه بالتماثل بوساطة كريسبر.
يضاف AAV إلى قطرة 30 ميكرولتر من وسائط KSOM للفئران بتركيز نهائي يبلغ 3 × 10 إلى نسخ الجينوم السابعة لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، يتم بعد ذلك نقل أجنة مرحلة خلية واحدة تم جمعها حديثا مع نواة مرئية إلى الوسائط التي تحتوي على AAV مما يسمح بحدوث نقل فيروسي. باستخدام بروتوكولنا ، ليست هناك حاجة لتخفيف المنطقة الشفافة لأن الأنماط المصلية AAV 1 و 6 قادرة على المرور بسهولة من أجل تسليم قالب إصلاح الحمض النووي بكفاءة.
يتم استزراع الأجنة باستخدام AAV طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة القصوى. في اليوم التالي ، يتم عمل خليط من التثقيب الكهربائي يحتوي على مائة نانوجرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الموجه الفردي ومائة نانوجرام لكل ميكرولتر من بروتين Cas9 المخفف في وسائط OptiMIM. يتم تحضين الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح بتكوين مجمعات CRISPR RNP.
أثناء وقت الحضانة ، يتم تشغيل جهاز الحفر الكهربائي ويتم توصيل الخيوط بأقطاب الشريحة الزجاجية. بعد اكتمال تكوين RNP ، يتم سحب خمسة ميكرولترات من خليط التثقيب الكهربائي بين الأقطاب الكهربائية ، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء إلى المحلول. تتم إزالة الأجنة ، الآن في مرحلة الخليتين ، من الوسائط التي تحتوي على AAV ونقلها بعناية إلى خليط التثقيب الكهربائي بين الأقطاب الكهربائية.
تتم محاذاة الأجنة ، مما يضمن عدم لمس أي منها لأي قطب كهربائي لأن هذا سيؤدي إلى التحلل أثناء التثقيب الكهربائي. هنا عرض لهذا الإجراء من خلال المجهر. من المهم أيضا ملاحظة أن المعاوقة ستنخفض مع زيادة الحجم بين الأقطاب الكهربائية.
لهذا السبب ، وحتى لا يخفف خليط التثقيب الكهربائي ، يجب نقل الحد الأدنى من الوسائط مع الأجنة. بعد ذلك ، يتم قياس المقاومة بالضغط على الزر برمز أوم عليه. يجب أن تكون المقاومة في حدود 0.18 إلى 0.3 أوم.
إذا كان في النطاق ، يتم بدء التثقيب الكهربائي بالضغط على زر البدء. تستغرق هذه العملية بضع ثوان فقط ، وهذا ما تبدو عليه من خلال المجهر. ستلاحظ فقاعات تتشكل بسرعة على كل قطب كهربائي.
مباشرة بعد التثقيب الكهربائي ، يتم جمع الأجنة من الشريحة الزجاجية وغسلها ثلاث مرات في وسائط KSOM للفئران الطازجة. يمكن بعد ذلك استزراع الأجنة للدراسات في المختبر أو نقلها إلى إناث بديلة لإنتاج ذرية حية. من المهم ملاحظة أن تورم الجنين شائع بعد التثقيب الكهربائي.
يجب أن يهدأ هذا التورم بعد بضع ساعات على الثقافة. ومن الشائع أيضا رؤية أحداث الاندماج الخلوي في ما يصل إلى 20٪ من جنينتين خليتين بعد التثقيب الكهربائي. يمكن تجنب الاندماج الخلوي عادة عن طريق محاذاة المحور الأفقي الدقيق للأجنة بين الأقطاب الكهربائية.
اختبار بروتوكولنا في أجنة الفئران وفحص الانفجارات المستزرعة لإدخال تسلسل إنترون اصطناعي قصير مهندس يحتوي على موقعين loxP. لاحظنا أن أكثر من 60٪ من الكيسات الأريمية تحتوي على أليل ضربة قاضية مستهدف بشكل صحيح بناء على تحليل تسلسل الجيل التالي. بعد ذلك ، إجراء مزيد من الاختبارات لبروتوكولنا لإنتاج فئران حية ، قمنا بتصميم مشروع لهندسة تسلسل طلاء Cre recombinase يستهدف موقع بدء ATG لجين DRD2 للفئران.
من بين 11 ذرية ولدت ، كانت 10 إيجابية من خلال تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل عبر ذراع التماثل الأولي الخماسي ، وثلاثة ذراع تماثل رئيسي ، ومقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل الداخلية للكشف عن Cre recombinase. كملخص على مدى سبعة مشاريع مختلفة ، حققنا معدل نجاح غير مباشر بنسبة 76٪ في المؤسسة على النحو الذي حدده تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل عبر تقاطعات ذراع التماثل والتحقق من تسلسل الحمض النووي. باستخدام توصيل الحمض النووي بوساطة AAV وخط أنابيب التثقيب الكهربائي للجنين الخلوي ، شهدنا كفاءات أعلى بكثير من الأساليب التقليدية لإدخال الحمض النووي حتى ثلاثة كيلوبايت في الطول.
من المهم أيضا ملاحظة أنه بينما أثبتنا استخدام هذا الإجراء في أجنة الفئران ، فقد يتم تطبيقه بشكل فعال على الأنواع الأخرى لتوليد إدخالات الحمض النووي المستهدفة أيضا.
