جيل من الفئران ذات الضربة القاضية الخاصة بالدهون البنية باستخدام نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 والفيروس أحادي التوجيه المرتبط بالغدي

يولد هذا البروتوكول فئران بالضربة القاضية خاصة بالدهون البنية باستخدام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 ونظام الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه المرتبط بالفيروس الغدي. يتضمن تقنية جراحية لإدارة AAV بأمان في الدهون البنية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تولد بسرعة خروج المغلوب الخاص بالأنسجة دون الحاجة إلى تربية الفئران بشكل انتقائي.

يمكن تكييف نهج صنع الضربة القاضية أو الضربة القاضية الخاصة بالأنسجة مع الأنسجة الأخرى إذا تم تعديل الإجراء الجراحي لحقن AAV بناء على العضو المستهدف. للبدء ، قم بتطبيق المسكن تحت الجلد على ماوس UCP1 Cre Cas9 المخدر لتقليل ومنع الألم والضيق بعد العملية الجراحية. ثم حلق الفراء في المنطقة بين الكتفين باستخدام ماكينة حلاقة ، وعقم المنطقة الجراحية بثلاث جولات متناوبة على الأقل من فرك قائم على اليود أو الكلورهيكسيدين ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول.

باستخدام مشرط ، قم بعمل شق بطول سنتيمترين في الجلد فوق الأنسجة الدهنية البنية بين الكتف لكشف الدهون بين الكتفين. بعد إجراء شق واحد ، قم بقطع الأنسجة الدهنية على الحدود بين المنطقة البعيدة من الأنسجة الدهنية والعضلات. ثم باستخدام المقص الجراحي في اليد المهيمنة ، قم بتقشير الأنسجة الدهنية بشكل صريح وعمودي لفضح الأنسجة الدهنية البنية أثناء قرص الأنسجة الدهنية ، بما في ذلك الأنسجة الدهنية البنية ، باليد غير المهيمنة.

استخدم وريد سولزر كمعلم للإشارة إلى موقع الأنسجة الدهنية البنية الدقيقة. بعد ذلك ، لكل فأر ، قم بحقن 20 ميكرولترا من الفيروس المرتبط بالغدي أو AAV ببطء في كل فص من الأنسجة الدهنية البنية باستخدام إبرة قياس 32 حادة متصلة بحقنة هاملتون سعة 100 ميكرولتر. تأكد من نجاح الحقن المشار إليه بعدم وجود تسرب من موقع الحقن أثناء إعطاء AAV.

بعد التأكد من التوازن ، ضع الأنسجة الدهنية المكشوفة مرة أخرى في وضعها الطبيعي لخياطة حافة الأنسجة الدهنية والعضلات باستخدام خيط حيدة قابل للامتصاص 5-0. أخيرا ، قم بخياطة الجلد المفتوح بخيوط مضفرة غير مصبوغة من VICRYL مغلفة 5-0. لا يمكن تحديد الموقع الدقيق للأنسجة الدهنية البنية دون تعريضها ، ومع ذلك ، فإن التعرض الزائد للأنسجة يلحق بالدم.

تضمنت العيوب المحتملة التي ربما أدت إلى الحقن غير الناجحة حقن محلول AAV في المنطقة غير الصحيحة ، واختراق الإبرة عبر الأنسجة ، وتضخم الأنسجة بسبب الحجم الزائد لمحلول AAV. كان التسليم الدقيق للحمض النووي الريبي أحادي التوجيه AAV إلى الأنسجة الدهنية البنية أمرا حاسما لنجاح البروتوكول. مفتاح النجاح أثناء تعريض الأنسجة الدهنية البنية هو تقنية المقص الجراحي ، بما في ذلك اتجاه وعمق المقص ، وموقع حقنة هاملتون.

تحتوي هذه التقنية على بالضربة القاضية خاصة بالأنسجة المولدة للحمل لفهم المنظمين الجزيئيين لاستقلاب الطاقة المرتبط بالدهون البنية.