يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في فهم آليات الحماية من هجمات المناعة الذاتية وتحديد الأهداف العلاجية لاستبدال خلايا بيتا في مرض السكري من النوع الأول. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التكلفة المنخفضة نسبيا ، وبساطة زراعة الخلايا ، وطرق الزرع والتصوير ، فضلا عن الحد الأدنى من غزو تقنيات الماوس. الأفراد الذين لم يسبق لهم إجراء حقن الوريد الذيل من قبل قد يكافحون لإدخال الإبرة في الوريد.
اطلب عرضا توضيحيا من قبل خبير قبل الحقن الأول. للبدء ، خذ الفأر المخدر وقم بإزالة الشعر من جانبه الظهري باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية مع واقي ، مما يعرض ما يقرب من بوصة واحدة في بوصتين من الجلد. أعد الماوس المحلوق إلى غرفة الضربة القاضية.
قبل عملية الزرع ، انقل فأرا واحدا في كل مرة من الغرفة إلى سطح نظيف مجهز بمخروط أنف إيزوفلوران وقم بتوجيه رأس الماوس برفق إلى مخروط الأنف. امسح المنطقة المحلوقة بوسادة تحضير كحول الأيزوبروبيل لإزالة الشعر المتساقط وتطهير الجلد. بعد ذلك ، اسحب أكثر من 300 ميكرولتر من تعليق الخلية في حقنة معقمة سعة ملليلتر واحدة مزودة بإبرة قياس 26.
قم بإزالة أي فقاعات من المحقنة واحتفظ ب 300 ميكرولتر من تعليق الخلية أثناء دفع الفائض. باستخدام زوج من الملقط المنحني المثبت في اليد غير المهيمنة ، ارفع الجلد برفق على جانب واحد من ظهر الماوس للسماح بوصول أسهل إلى المساحة تحت الجلد. ثم باستخدام اليد المهيمنة ، ضع المحقنة بالتوازي مع السهول الإكليلية والسهمية لجسم الماوس.
مع توجيه الإبرة نحو رأس الفأر ، أدخلها في الجلد بالقرب من الأرباع الخلفية وقم بتوجيهها إلى الفضاء تحت الجلد مع التأكد من بقاء الإبرة بأكملها تحت الجلد وعدم اختراقها. اضبط الملقط لتثبيت الجلد حول قاعدة الإبرة. استغني ببطء عن أقل من 50 ميكرولتر من تعليق الخلية وتأكد من تكوين انتفاخ صغير تحت الجلد في موقع الحقن.
استمر في حقن ما يصل إلى 200 ميكرولتر من تعليق الخلية تحت الجلد. ثم أمسك الملقط في مكانه وحافظ على الإبرة موازية لجسم الماوس ، اسحب الإبرة. بمجرد إزالة الإبرة ، أغلق الجلد بالملقط لبضع ثوان لمنع الخلايا من التسرب من جرح البزل.
بعد عملية الزرع ، انقل كل فأر إلى قفص جديد واسمح للحيوان بالتعافي تماما من التخدير قبل إضافة فئران إضافية إلى القفص. عند وضع الفأر الرحيم على ظهره ، استخدم المقص الجراحي لعمل شق عمودي بطول بوصتين تقريبا في الجلد. قطع فتح الجانب الأيمن من الماوس وتحديد موقع الطحال الأحمر مشرق.
قطع الطحال بلطف بعيدا عن البنكرياس الوردي ونقله إلى طبق بتري معقم 10 سم يحتوي على خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم. يهرس الطحال مع الجزء العلوي المسطح من مكبس حقنة معقمة. ضع مصفاة 40 أو 70 ميكرون على أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر وقم بتزويدها بخمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
نقل تعليق الطحال إلى مصفاة وهرسها بلطف. اغسل الطبق ب 10 ملليلتر من PBS وانقل الغسيل إلى المصفاة. استمر في الهرس حتى لا يبقى لون أحمر على المصفاة.
ثم قم بتدوير الأنبوب بسرعة 500 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة شفط قبل تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من محلول تحلل ACK الذي تم تسخينه مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة لأداء تحلل خلايا الدم الحمراء في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. قم بإخماد التفاعل بخمسة ملليلتر من وسائط الخلية NIT-1 لكل خمسة ملليلتر من محلول التحلل ومرر تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر من خلال مصفاة جديدة لإزالة الكتل. أدر الأنبوب عند 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 20 ملليلتر من PBS قبل عد الخلايا. بعد العد ، قم بتدوير الخلايا عند 500 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق حبيبات الخلية في برنامج تلفزيوني معقم في أنبوب تفاعل قفل آمن سعة 1.5 ملليلتر.
إما أن تحقن على الفور أو تخزن الخلايا على الثلج لمدة أقصاها ساعة واحدة. قم بتسخين جسم الفئران NOD SCID المتلقية البالغة باستخدام مصباح حراري لمدة خمس إلى 10 دقائق لتوسيع الأوردة وعاء. أعد تعليق محلول الخلايا الطحالية قبل كل حقنة.
لكل ماوس ، ارسم 100 ميكرولتر من تعليق الطحال المسخن مسبقا في المحقنة ، وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء. بعد ذلك ، ضع الماوس في جهاز ضبط النفس قبل التقاط ذيله باليد غير المهيمنة. حدد موقع أحد أوردة الذيل الجانبية.
قم بتدوير الذيل برفق إذا لزم الأمر. امسح الذيل بمناديل تطهير تحتوي على 70٪ كحول الأيزوبروبيل. باستخدام اليد المهيمنة ، أدخل الإبرة بزاوية حادة في المنطقة الوسطى من الذيل.
مع توجيه شطبة الإبرة لأعلى ، حرك الإبرة بضعة ملليمترات عبر الجلد. ثم اضغط برفق على المحقنة لحقن تعليق الطحال. لا تسمح للإبرة بالتحرك أكثر للداخل أو للخارج عند الحقن.
لا تؤدي الحقن الناجحة إلى ضغط الظهر أثناء الحقن ويشار إليها بتدفق الدم الشفاف أو الأبيض مباشرة بعد الحقن. بعد الحقن ، حرر الإبرة برفق من الوريد واضغط ضغطا خفيفا على الذيل بمسح التطهير حتى يتوقف النزيف. حرر الماوس من جهاز ضبط النفس وانقله برفق إلى قفص معد حديثا.
قبل التصوير بخمس دقائق على الأقل ، قم بحقن الماوس داخل الصفاق بالجرعة المناسبة من محلول D-luciferin باستخدام حقنة واحدة ملليلتر وإبرة قياس 26. بعد تسجيل الدخول إلى برنامج التصوير ، في لوحة التحكم ، حدد تهيئة. للحفظ التلقائي لبيانات التصوير ، انقر فوق اكتساب متبوعا بالحفظ التلقائي إلى وإنشاء المجلدات المناسبة في الكمبيوتر.
بمجرد انتهاء تهيئة الجهاز ، اضبط وقت التعرض على دقيقة واحدة. ضع الماوس على أداة التصوير في وضع الانبطاح مع بسط أطرافه وتوجيه رأسه إلى مخروط الأنف. قم بتسطيح الماوس برفق عن طريق الضغط على منتصف ظهره بكلتا يديه ثم نشر اليدين للخارج وبعيدا عن بعضهما البعض.
ثم في برنامج التصوير ، حدد الحصول على أي تفاصيل ذات صلة بالتجربة وتسجيلها في النافذة المنبثقة. في اثنين من الفئران الثلاثة التي تمت دراستها ، تم تدمير طعم التحكم بحلول اليوم 18 كما يتضح من فقدان إشارات التوهج الحيوي المعنية. ومع ذلك ، في الفأر الآخر ، تم تدمير الكسب غير المشروع الطافر بينما نجا طعم التحكم ، مما يسلط الضوء على التباين البيولوجي بين الحيوانات.
تم تحديد إشارة التوهج الحيوي وتم الإبلاغ عن بقاء الكسب غير المشروع كنسبة مئوية لإشارة التوهج الحيوي المتبقية مقارنة بالإشارة في النقطة الزمنية الأولى. تم استخدام نسبة إشارات الإنارة من الكسب غير المشروع الطافر إلى طعم التحكم لكل فأر لتصور الاختلاف بين الحيوانات. قبل نقل المرض ، قد تتكاثر الخلايا المزروعة مما يؤدي إلى توسيع الطعوم المرئية من خلال الجلد.
عند التصوير ، أظهرت هذه الطعوم إشارات مضيئة بيولوجيا مشبعة لا يمكن قياسها بدقة. يمكن عزل الطعوم في نقاط زمنية مختلفة لتوصيف الخلايا المناعية المتسللة عن طريق ، على سبيل المثال ، قياس التدفق الخلوي للتحقيق في آليات هجوم المناعة الذاتية وحماية الكسب غير المشروع.
