لقد طورنا نهجا في المختبر لتوصيف ميكانيكا المواد الهلامية actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي للخلية ، وبشكل أعم ، السيتوبلازم ، والتي ثبت أنها تتصرف كمادة فعالة poroelastic. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة حول كيفية مساهمة انقباض الميوسين في ظهور تدفق السوائل وكيف ترتبط سرعات الشبكة والسيتوسول في الزمان والمكان. يسمح لنا هذا النهج البسيط باستخراج الخصائص الميكانيكية للأنظمة المتطورة ديناميكيا دون استخدام أي معدات أو تقنيات متطورة حيث لا يمكن استخدام الأدوات التقليدية مثل AFIM.
يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على ريولوجيا المواد الفعالة المسامية المرنة بغض النظر عن خصوصية الجل النشط والسائل المضمن. للبدء ، ضع 10 إلى 12 غطاء زجاجي رقم 1.5 في حامل بولي تترافلوروإيثيلين محلي الصنع وقم بإعداد محلول سمكة البيرانا في دورق سعة 400 ملليلتر. تحضير الحل على الجليد في غطاء كيميائي.
انقل الحامل إلى دورق مملوء بسمكة البيرانا. بعد ثلاث ساعات ، انقل الحامل إلى دورق نظيف مملوء بالماء المقطر المزدوج الطازج لغسل سمكة البيرانا الزائدة من أغطية الغطاء ونقل الدورق إلى حمام صوتنة عند 80 هرتز والطاقة الكاملة لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين بالماء المقطر المزدوج النقي.
للتملح ، انقل الحامل إلى دورق نظيف مملوء ب 300 مل من الميثانول النقي ، ثم إلى حمام صوتنة لمدة 30 دقيقة. ثم انقل الحامل إلى محلول silane. أغلق الدورق بالبارافيلم واحتفظ به في الثلاجة عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
في اليوم التالي، انقل الحامل إلى كأس زجاجية نظيفة مملوءة ب 300 ملليلتر من الميثانول النقي لمدة 15 ثانية. جفف الجزء السفلي من الحامل لإزالة الميثانول الزائد ونقله إلى دورق نظيف. ثم انقل الدورق إلى الفرن لتجفيف الأغطية الزجاجية لمدة خمس دقائق عند 120 درجة مئوية.
لتحقيق التخميل السطحي ، خذ اثنين من أغطية الغطاء لكل تجربة ووضعها في طبق بتري مغطى بطبقة بارافيلم تم تنظيفها في البداية بالإيثانول. احتضن كل غطاء مع ملليلتر واحد من ميثوكسي بولي إيثيلين جلايكول ماليميد في 1X PBS لمدة ساعة واحدة عند 22 درجة مئوية. في نهاية عملية الحضانة ، قم بإمالة طبق بتري لإزالته وربطه.
شطف كل غطاء مع خمسة ملليلتر من الماء المقطر المزدوج وجفف مع تدفق غاز النيتروجين. نظرا لأنه يجب أن تبقى أغطية الغطاء مبللة بعد التخميل ، ضع على الفور ملليلتر واحد من 10 مليمولار تريس على الأسطح pegylated واستخدم أغطية الغطاء لمدة ساعتين. لتكوين مجاميع الميوسين الكبيرة، خفف محلول مخزون الميوسين باستخدام 10 ملليمولار تريس للوصول إلى تركيز نهائي قدره 25 مليمول كلوريد البوتاسيوم.
احتفظ بمحلول الميوسين المخفف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم انقله إلى الثلج حتى الاستخدام. المحركات نشطة بالكامل لمدة تصل إلى ساعتين. لتتبع تدفق المذيبات عبر مسام الجل ، قم بإعداد حبات الفلورسنت المخملة وتقليل التفاعل بين الخرز وشبكة actomyosin عن طريق احتضان ميكرولتر واحد من الخرز بخمسة ميكرومولار G-actin لمدة 20 دقيقة.
قم بإزالة G-actin الزائد عن طريق الطرد المركزي. كرر هذه الخطوة مع 10 ملليغرام لكل ملليلتر من ألبومين مصل الأبقار لمنع السطح غير المطلي المتبقي واستخدام الخرزات بتخفيف نهائي من واحد إلى 10،000 في التجارب. لتحضير محلول الأكتوميوسين ، قم بإذابة حصص البروتين المخزنة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر وضعها على الجليد.
ثم قم بإعداد المحلول للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10 مللي مولار تريس ، وخمسة ميكرومولار G-actin ، و 280 نانومولار GST Fascin ، و 1.67 نانومولار ميوسين II.خذ أحد أغطية البولي إيثيلين جلايكول المخملة. ضع فاصل بارافورم مدهون فوقه وضعه في حامل العينة. أضف 1.1 ميكرولتر من محلول الأكتوميوسين إلى غطاء الغطاء المثبت على الحامل وضع غطاء الغطاء الثاني في الأعلى.
المسمار حامل لختم العينة. ضع حامل العينة على المجهر وابدأ عملية الاستحواذ. تحضير المجهر مقدما لتقليل وقت الاستحواذ الأولي.
لتصوير العينات باستخدام مجهر فلوري مقلوب ، تصور منطقة الهلام بأكملها باستخدام تكبير منخفض لهدف 2.5X واتبع تقلصه العياني مع مرور الوقت. استخدم هدف 10X لتوصيف مسامية الشبكة وهيكلها ومتابعة التنظيم الذاتي للشبكة وتقلصها مع مرور الوقت. للتصوير المتزامن بلونين، قم بإثارة الأكتين عند 488 نانومتر ومحركات الميوسين II عند 561 نانومتر وسجل الصور في وقت واحد على كاميرا EMCCD باستخدام جهاز انبعاث مزدوج.
استخدم نفس نظام التصوير لتصوير هلام الأكتين ومحركات الميوسين II الفلورية في وقت واحد. للتصوير المتزامن بلونين ، قم بإثارة الأكتين عند 488 نانومتر و 2،300 حبة نانومتر عند 561 نانومتر. وسجل الصور في وقت واحد على كاميرا EMCCD باستخدام جهاز انبعاث مزدوج.
استخدم نفس نظام التصوير لتصوير جل الأكتين وخرز الفلورسنت في وقت واحد. يتضمن اليوم الأول إثبات أن شبكة الأكتوميوسين تتصرف كمادة مرنة. يصور هنا تمثيل تخطيطي لشبكة أكتوميوسين.
تظهر صور الفحص المجهري الفلوري أن خيوط الأكتين تنوي تلقائيا وتتبلمر في شبكة مترابطة الخواص تخفف مع مرور الوقت وتتقلص في النهاية مجهريا. يبدأ جذب الشبكة في محيط الهلام وينتشر إلى الداخل في الجزء الأكبر من الهلام. يتم تمييز مركز الهلام ب C.تظل حزم خيوط الأكتين مستقيمة أثناء تقلص الشبكة.
يوضح هنا توزيع النسبة بين طول الكفاف والمسافة من طرف إلى طرف عند T316 ثانية و T327 ثانية. يتضمن الهدف الثاني إثبات أن سريان المذيب الخارجي يتولد عن انقباض الميوسين. تظهر هنا صورة الجل عند التكبير المنخفض في المراحل المتوسطة من الانكماش.
تشير هذه الدوائر إلى مواضع أربع خرزات. تشير الأسهم إلى الاتجاه العام لحركة الخرزة. يتم تصوير مسارات الخرزات التسعة المختارة هنا.
يتم هنا توضيح حل مسامية الشبكة وحركة المذيب عبر مسام الهلام في المراحل المتقدمة من الانكماش. الهدف الثالث ينطوي على إثبات أن استرخاء الإجهاد يتميز بثابت انتشار مرن فعال. تظهر هنا صور مضان للمنظر العلوي لهلام أكتوميوسين متقلص عند التكبير المنخفض من وقت الخلط حتى الحالة المستقرة.
تتصرف شبكات actomyosin كمادة فعالة poroelastic. أثناء محاولة هذا الإجراء ، اعمل بسرعة ودقة وتذكر أهمية الحفاظ على السطح.
