يسمح هذا البروتوكول للباحثين بمراقبة كيفية استجابة C-elgans لناهض مستقبلات الأسيتيل كولين Levamisole. يمكن أن تشير حساسية ليفاميزول المتغيرة إلى عيوب في الإشارات عند التقاطع العصبي العضلي أو وظيفة العضلات. الميزة الرئيسية هي أن السباحة القوية ل C-elgans في حل Levamisole تسمح للباحثين بقياس الشلل المعتمد على الوقت لمئات الديدان في ساعة واحدة فقط.
يمكن أن يكون حساب عدد الديدان في كل بئر كل خمس دقائق أمرا ساحقا. يمكن تعديل عدد الآبار التي تم فحصها أو النقاط الزمنية إذا لزم الأمر. للبدء في إعداد وسائط نمو الديدان الخيطية عن طريق الجمع بين ثلاثة غرامات من كلوريد الصوديوم ، و 2.5 غرام من نغمة بيب ، و 17 غراما من الأجار مع لتر واحد من الماء منزوع الأيونات في قارورة مع شريط تحريك.
بعد التعقيم ، ضع الوسائط على صفيحة ساخنة مضبوطة على 70 درجة مئوية وحرك بسرعة معتدلة لمدة ساعة واحدة. أضف ملليلتر واحد من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من الكوليسترول بقطرة لمنع هطول الأمطار. ملليلتر واحد من كلوريد الكالسيوم المولي واحد ، ملليلتر واحد من كبريتات المغنيسيوم المولية ، و 25 ملليلتر من واحد من المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم المولى 6.0 إلى الوسائط.
انقل ملليلترين من وسائط نمو الديدان الخيطية إلى كل بئر من صفيحة بئر 24 مع ماصة مصلية معقمة. السماح للأطباق أن تجف على سطح المقعد لمدة يومين قبل الجلوس مع البكتيريا. اختر مستعمرة واحدة من 50 في مرق B واضبط الثقافة تهتز عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
باستخدام ماصة معقمة ، قم بإسقاط 30 ميكرولتر من تعليق OP50 على الأجار في منتصف كل بئر. دع الأطباق تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين على الأقل بعد الجلوس للسماح بتكوين العشب البكتيري. تنمو الأنواع البرية unc-63 Lev10 و unc-49 C-elgan حتى مرحلة البلوغ على ألواح ستة سنتيمترات ، وإعداد ما لا يقل عن ثمانية ألواح لكل سلالة.
تحضير محلول التبييض تحت غطاء المحرك في يوم المزامنة. امزج 10 ملليلتر من المبيض و 2.5 ملليلتر من هيدروكسيد الصوديوم و 37.5 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات في أنبوب مؤرخ سعة 50 ملليلتر. باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، اغسل الديدان البالغة الجرافية من أربعة ألواح على الأقل مع مخزن مؤقت M9 وانقلها إلى أنبوب مؤرخ سعة 15 ملليلتر.
قم بتدوير هذا 716 G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ثم قم بإزالة الناتانت الفائق باستخدام ماصة نقل. أضف 10 ملليلتر من محلول التبييض. هز الأنبوب بلطف لمدة أربع دقائق حتى يذوب معظم جثث الدودة ، ولكن ليس كلها.
تدور في 716 G لمدة دقيقة واحدة. صب محلول التبييض في حركة واحدة. طالما أن الأنبوب لا يهتز في هذه المرحلة ، فإن البيض سوف يلتصق بجانب الأنبوب عند 15 ملليلتر من المخزن المؤقت M9 وعكسه.
تدور على 716 G لمدة دقيقة واحدة وتصب المخزن المؤقت M9 في حركة واحدة سلسة. كرر هذا الغسيل بمحلول عازل ثلاث مرات. بعد الغسيل النهائي ، أضف 10 ملليلتر من M9 الطازج وضعه على دوار طوال الليل عند 15 درجة مئوية لعزل مجموعة متزامنة من المرحلة اليرقية الأولى الجائعة.
اطبع إلى 24 لوحة بئر وقم بتعيين سلالات إلى أماكن عشوائية. بعد حوالي 24 ساعة من إعداد المبيض ، قم بتدوير ديدان L1 الجائعة عند 716 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة ما يقرب من تسعة ملليلترات من المخزن المؤقت M9 باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، ثم امزج بلطف ديدان المرحلة اليرقية الأولى الجائعة في المخزن المؤقت M9 المتبقي.
قم على الفور بماصة ثلاثة ميكرولترات من الديدان والمخزن المؤقت M9 على شريحة المجهر وتحديد عدد L1. الرقم المطلوب هو 20 إلى 30 L1 في ثلاثة ميكرولترات. ماصة ثلاثة ميكرولترات من L1 في كل بئر وفقا لخريطة لوحة مسبقة الصنع ، دع الديدان تنمو إلى مرحلة البلوغ لمدة ثلاثة أيام عند 20 درجة مئوية.
اطبع ورقة البيانات الفارغة التي سيتم استخدامها لتسجيل عدد الديدان التي تتحرك في كل بئر كل خمس دقائق لمدة ساعة واحدة. تحقق من الديدان في لوحات البئر 24. باستخدام علامة ، اصنع علامة X على غطاء اللوحة فوق أي آبار بها تلوث أو تتضور جوعا أو تحتوي على الكثير من الديدان ، مما سيجعل العد صعبا.
اصنع محلول ليفاميزول 0.4 ملليمولار بإضافة 200 ميكرولتر من مخزون ليفاميزول 100 مللي مولي إلى 50 ملليلتر من M9. ابدأ تشغيل مؤقت ثم باستخدام ماصة نقل أضف ملليلتر واحد من 0.4 ملليمول من الليفاميزول إلى البئرين الأولين ، بحيث تسبح الحيوانات بحرية. استمر في إضافة ليفاميزول إلى الآبار المجاورة ، مما أدى إلى تأخير الوقت وفقا لعدد الآبار التي سيتم فحصها. في خمس دقائق ، ابدأ في حساب عدد الديدان المتحركة في كل بئر يدويا ، بدءا من البئر الأول ، وسجل هذا الرقم في ورقة البيانات.
استمر في حساب عدد الديدان المتحركة في كل بئر كل خمس دقائق لمدة ساعة واحدة. في نهاية الفحص أو عندما يسمح الوقت ، سجل العدد الإجمالي للديدان في كل بئر. احصل على اللوحة والخريطة والسجل الذي يتوافق مع كل بئر.
أدخل البيانات في جدول بيانات يبدأ بالعدد الإجمالي للديدان في كل بئر ، وينظم حسب النمط الوراثي. الجمع بين البيانات من الآبار ، وتحديد عدد الديدان التي تتحرك في كل نقطة زمنية. استخدم هذا لحساب الرقم الذي يشل في كل نقطة زمنية.
أنشئ جدول بيانات بحيث يشير العمود الأيسر إلى الوقت، وتحتوي الأعمدة اللاحقة على البيانات الخاصة بكل سلالة. لكل يصاب بالشلل خلال الدقائق الخمس الأولى ، قم بإنشاء صف وأدخل صفا لمدة خمس دقائق. كرر هذا لكل نقطة زمنية.
بالنسبة لجميع الحيوانات التي لا تشل بنهاية الفحص ، أدخل صفرا لمدة 60 دقيقة. استخدم هذه البيانات لإنشاء منحنى البقاء على قيد الحياة في البرنامج الإحصائي المحدد المستخدم هنا لعرض الشلل المعتمد على الوقت للسكان بصريا. يجب إدخال البيانات الخاصة بجميع السلالات التي تم فحصها في نفس جدول البيانات ، مع ترك المسافات حسب الضرورة.
الطفرات في الوحدات الفرعية لمستقبلات أستيل كولين ليفاميزول ، وكذلك في الجينات اللازمة لتجميع مستقبلات الأسيتيل كولين الحساسة بعد الليفاميزول المشبكي ، تسبب مقاومة للشلل الناجم عن ليفاميزول كما لوحظ في الطفرات unc-63 و Lev-10 على التوالي. تسبب فقدان القناة الأيونية ذات بوابات GABA unc-49 في فرط حساسية ليفاميزول بسبب اضطراب التوازن السليم للإشارات الكولينية و GABAergic. التحضير السليم ل 24 لوحة بئر أمر ضروري.
إذا لم تكن المروج البكتيرية جافة قبل اكتشاف محلول L1 ، فقد يصبح محلول Levamisole غائما أثناء الفحص ، مما يمنع الملاحظة. من خلال تعديل لوحات البئر ال 24 ، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام الحيوانات التي تم إسقاطها بواسطة RNAi. هذا يسمح للباحثين بدراسة جينات C-elgan ، والتي لا تتوفر لها الطفرات.
