إنه بروتوكول سهل ومتصور يوضح التعامل مع المواد العضوية لسرطان المريء الغدي في عمليتين مختلفتين للزراعة الفرعية مع وبدون هضم خلية واحدة. يمكن للبروتوكول الموحد لزراعة المواد العضوية EAC بطريقتين مختلفتين أن يدعم الباحثين في اختيار التقنيات المناسبة لتطبيقات المصب المختلفة في تجاربهم القائمة على شركة تنمية نفط عمان. أثناء التعامل مع شركات تنمية نفط عمان ، من الضروري الانتباه إلى التفاصيل في كل خطوة.
يعد الإجراء التشغيلي الموحد القائم على الفريق أمرا بالغ الأهمية لجودة أصحاب الهمم. سيكون أحد طلاب الدكتوراه لدينا نينغ بو فان وليزا راتز ، مساعد التقنية في المختبر. قم بتسخين صفيحة من 12 بئرا عن طريق الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية باستخدام ثاني أكسيد الكربون.
إذا كان ذلك متاحا ، استخدم الآبار الفارغة من طبق به ثقافة عضوية مشتقة من المريض. احتضان كمية مناسبة من جل ECM لمدة ساعة واحدة على الجليد لتسييله. ضع محلول استعادة الخلية على الجليد.
قم بإزالة اللوحة مع منظمات تنمية نفط عمان المتنامية من الحاضنة. شفط الوسط القديم باستخدام مضخة تفريغ. أضف 500 ميكرولتر لكل قبة من محلول استعادة الخلايا الباردة الجليدية في البئر.
قم بتفكيك هلام ECM عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفتيت قباب هلام ECM إلى قطع صغيرة باستخدام 1000 طرف ميكرولتر مع فتحة واسعة. اجمع بين محلول PDO و ECM gel و cell recovery من بئرين كحد أقصى وانقله إلى أنبوب منخفض الربط بسعة خمسة ملليلترات. احتضن هذا الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة.
اخلط كل خمس دقائق عن طريق عكس الأنبوب. جهاز طرد مركزي للأنبوب بسرعة 500 مرة G لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية. إذا لم يكن هناك حبيبات مرئية ، فقم بإزالة supernatant بعناية باستخدام مضخة تفريغ حتى يتم الوصول إلى المرحلة التي تحتوي على محلول ECM gel PDO وإضافة ثلاثة ملليلترات من محلول استعادة الخلايا الباردة الثلجية.
اقلب الأنبوب عدة مرات واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق أخرى. جهاز طرد مركزي بسرعة 500 مرة G لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة بعناية باستخدام مضخة تفريغ أو ماصة سعة 1000 ميكرولتر.
حاول إزالة supernatant قدر الإمكان. قم بتخزين حبيبات شركة تنمية نفط عمان على الجليد. قم بإزالة أطراف 201,000 ميكرولتر المبردة مسبقا باستخدام فتحة واسعة من الفريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر وضعها على مقعد نظيف.
احسب 50 ميكرولتر من هلام ECM لكل قبة مخطط لها للبذر ، بالإضافة إلى 50 ميكرولتر إضافي. ثم أعد تعليق الكريات في هلام ECM باستخدام طرف 1000 ميكرولتر مبرد مسبقا واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات. قم بإزالة الصفيحة ذات ال 12 بئرا المسخنة مسبقا من الحاضنة قبل بذر القباب.
زرع القباب التي تحتوي على 50 ميكرولتر من هلام ECM في اللوحة الدافئة. احتضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 إلى 30 دقيقة لتصلب هلام ECM. أضف وسط شركة تنمية نفط عمان المسخن مسبقا بعناية دون إزعاج القباب.
مراقبة منظمات تنمية نفط عمان المبذرة تحت المجهر. استزرع مكاتب تنمية نفط عمان لمدة 7 إلى 14 يوما حتى تحدث الكثافة والمورفولوجيا المطلوبة. تحضير وسط الهضم عن طريق خلط ملليلترين من 0.25٪ من التربسين EDTA و 20 ميكرولتر DNAase I لهضم PDOs التي يتم حصادها من بئرين.
أعد تعليق الكريات المعدة مسبقا في حجم مناسب من 0.25٪ من التربسين EDTA و DNAase I المسخنين مسبقا واخلطها حوالي 10 مرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. احتضان لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة دوارة بسرعة دوران لا تقل عن 28 دورة في الدقيقة. تحضير أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على ستة ملليلتر من محلول مثبطات التربسين فول الصويا.
بعد الهضم، امزج منظمات تنمية نفط عمان المهضومة جيدا عدة مرات مع ماصة 1000 ميكرولتر لتعطيل منظمات تنمية نفط عمان. انقل PDOs المهضومة إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على محلول SDI لوقف الهضم. جهاز طرد مركزي بسرعة 500 مرة G لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية.
تخلص من المادة الفائقة بعناية باستخدام مضخة تفريغ أو ماصة سعة 1000 ميكرولتر. أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من الوسط القاعدي. تحديد تركيز الخلية وقابليتها للحياة باستخدام عداد خلية آلي أو مقياس دمية.
احسب رقم الخلية وفقا للقباب المخطط لها للبذر ، بالإضافة إلى قبة واحدة إضافية ، وانقلها إلى أنبوب ربط منخفض جديد 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي بسرعة 500 مرة G لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص بعناية من supernatant باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
أضف الحجم المناسب من جل ECM إلى الكريات باستخدام طرف فتحة عريض 1000 ميكرولتر مبرد مسبقا. اخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات. زرع PDOs المهضومة في صفيحة من 12 بئرا كما هو موضح سابقا.
ابدأ عملية الحفظ بالتبريد ل PDOs غير المهضومة باستخدام حبيبات معدة مسبقا. استخدم 500 ميكرولتر من وسط التجميد البارد لإعادة تعليق الكريات من قبتين ونقلها إلى قارورة مبردة. قم بتجميد منظمات تنمية نفط عمان طوال الليل في الفريزر باستخدام حاوية تجميد الخلايا المناسبة.
انقل منتجات تنمية نفط عمان المجمدة إلى فريزر 150 درجة مئوية تحت الصفر. للحفظ بالتبريد ل PDOs المهضومة ، انقل الخلايا إلى أنبوب ربط منخفض جديد 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي بسرعة 500 مرة G لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية.
تخلص من السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من وسط التجميد وانقلها إلى قارورة مبردة. قم بتجميد منظمات تنمية نفط عمان طوال الليل في ثلاجة 80 درجة مئوية تحت الصفر باستخدام حاوية تجميد الخلايا المناسبة ونقلها إلى فريزر 150 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين على المدى الطويل.
يستغرق التزريع الفرعي دون هضم خلية واحدة وقتا أقل للوصول إلى كثافة مماثلة ويؤدي بشكل أساسي إلى هياكل مدمجة. وعلى النقيض من ذلك، تظهر منظمات تنمية نفط عمان المهضومة ذات الخلية الواحدة هياكل ذات نواة جوفاء. يوضح الشكل تلطيخ الهيماتوكسيلين الإيوسين وتلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية ل EAC PDOs المضمنة في البارافين مع هياكل مدمجة ومجوفة.
يتيح البانسيتوكيراتين تحديد الخلايا السرطانية الظهارية. يسلط السيتوكيراتين 7 الضوء على الخلايا السرطانية المتمايزة الغدية. توجد البنية المدمجة في الغالب في الثقافة غير المهضومة ، في حين أن البنية المجوفة هي المهيمنة في الثقافة التي خضعت لعملية هضم خلية واحدة.
يسلط Ki67 الضوء على مجموعات الخلايا ذات الانتشار الخلوي الأعلى. تم توزيع Ki67 باللون الأحمر و PanCK باللون الأخضر بالمثل بين الأنسجة الأولية لشركة EAC والهيكل المضغوط لشركة تنمية نفط أفريقيا والهيكل المجوف لشركة EAC PDO. ويبين الشكل الخصائص المورفولوجية لمنظمات تنمية نفط أفريقيا التابعة لجماعة شرق أفريقيا في اليوم الأول من الاسترداد من المخزون المجمد مع الحفظ بالتبريد القائم على خلية واحدة والحفظ بالتبريد القائم على أساس شركة تنمية نفط عمان غير المهضوم.
نوصي بوضع خطة واضحة للثقافة الفرعية مقدما. يعد التحكم في درجة الحرارة والسحب اللطيف ضروريين للتعامل الصحيح مع المواد الهلامية ECM عند الزراعة الفرعية لشركة تنمية نفط عمان. يوفر بروتوكولنا للباحثين القدرة على الحفاظ على نقاط PDO الخاصة بهم في EAC وفقا لغرض دراستهم للتحليل النهائي مثل فحص الأدوية أو قياس التدفق الخلوي أو التحليل النسيجي.
نأمل أن يساعد عملنا الباحثين العضويين على اتخاذ قرارات سريعة وسهلة لتخزين المواد العضوية وزراعتها الفرعية ، خاصة بالنسبة للنتائج القوية للمواد المشتقة من المرضى في الأبحاث الانتقالية.
