الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه أقل كثافة في العمل واستهلاكا للوقت من الطريقة التقليدية لحساب وحدات تشكيل المستعمرة لتقدير النمو داخل الخلايا للمتفطرة السلية. تسهل هذه التقنية على الباحثين فحص الأدوية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء بسرعة بهدف إعادة توظيفها كعلاجات موجهة للمضيف لعلاج السل. الطريقة بسيطة جدا ومباشرة.
ستكون المعرفة الأساسية بتقنيات زراعة الخلايا التائية المتفطرة و EO الحاملة كافية لاتباع البروتوكول خطوة بخطوة. للبدء ، انقل ستة إلى ثمانية ملليلتر من ثقافة المتفطرات الموهنة H37Ra من قارورة T25 إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
بعد إزالة الأنبوب بعناية ، انقل الأنبوب إلى خزانة السلامة البيولوجية وانتظر دقيقة واحدة حتى تستقر البكتيريا. صب المادة الطافية في حاوية التخلص من المطهر. بعد ذلك ، قم بتغليف الأنبوب وتعليق البكتيريا في الوسط المتبقي عن طريق النقر على جانب الأنبوب برفق والسماح للبكتيريا بالاستقرار لمدة دقيقة واحدة.
أضف واخلط مليلتر من RPMI الكامل الذي تم تسخينه مسبقا وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. لإعادة تعليق المتفطرات ، ارسم التعليق في حقنة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 25. بعد ذلك ، أخرج برفق شديد أسفل الجدار الجانبي للأنبوب لتقليل إنتاج الهباء الجوي ، وكرر العملية من ست إلى ثماني مرات.
تخلص من الإبرة والمحقنة في حاوية الأدوات الحادة في خزانة السلامة البيولوجية. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي لحبيبات أي كتل متبقية. أعد الأنبوب إلى خزانة الأمان واترك البكتيريا تستقر لمدة دقيقة واحدة.
نقل العلوي 1 إلى 1.5 ملليلتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد. تخلص من الأنبوب الأصلي في دلو النفايات الذي يحتوي على المطهر. تخلط جيدا وتضاف كميات مختلفة من تعليق المتفطرات إلى منزلقتي الغرفة الزجاجية بشكل جيد ، واحتضان الشرائح لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية.
بعد السحب لأعلى ولأسفل ثلاث مرات لإزاحة البكتيريا غير البلعمية ، قم بإزالة الوسط من شريحة الغرفة الزجاجية. تغسل مرة واحدة مع اثنين ملليلتر من برنامج تلفزيوني. قم بإذابة حصص 4٪ PFA في PBS المخزنة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.
تمييع القسمة إلى 2٪ PFA وإضافة اثنين ملليلتر إلى كل بئر. بعد الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة الشريحة من خزانة الأمان للتلطيخ. تخلص من PFA في حاوية النفايات الكيميائية PFA واغسل الشريحة تحت تيار لطيف من ماء الصنبور.
باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، قم بتوزيع ما يكفي من الأورامين لتغطية الخلايا الموجودة على الشريحة ، واحتضان الشريحة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل الصبغة الزائدة من الشريحة بماء الصنبور وأضف المروي لمدة دقيقة واحدة في الظلام. بعد غسل المروي الزائد ، احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع وصمة عار Hoechst في الظلام.
ثم يغسل وصمة عار Hoechst. وبعد تصريف المياه الزائدة ، أضف قطرة من مضاد التلاشي وزلة غطاء. افحص الشريحة المجففة بالهواء تحت مجهر الفلورسنت باستخدام هدف الزيت 100x.
سوف تتألق المتفطرات باللون الأخضر تحت مرشح فيتز وستتألق النوى باللون الأزرق تحت مرشح DAPI. احسب عدد المتفطرات البلعمية لكل خلية والنسبة المئوية للخلايا المصابة لتحديد MOI. احسب حجم تعليق المتفطرات اللازم لتحقيق MOI المطلوب بناء على مساحة سطح البئر في اللوحة.
بعد خلط معلق المتفطرات ، أضف الحجم المحسوب إلى الخلايا الموجودة على 12 لوحة بئر لتحقيق MOI المطلوب. احتضان الصفيحة عند 37 درجة سلزية لمدة ثلاث ساعات للسماح للبكتيريا بالبالعمجة. ثم قم بإزالة البكتيريا خارج الخلية عن طريق غسل الآبار باستخدام RPMI الدافئ عدة مرات.
أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل لمدة 10 دقائق لتحليل البلاعم في بئر واحدة من العينة التي تستغرق ثلاث ساعات ، واجمع المحللة لتحديد معدل الإصابة الأساسي. ثم أضف RPMI الكامل الجديد وجرعات الدواء المطلوبة ، أو التحكم في السيارة ، إلى الآبار المتبقية. احتضان الألواح في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى ثمانية أيام ، اعتمادا على تصميم التجربة.
لتحديد النسبة المئوية للوقت اللازم للإيجابية ، أو TTP ، للتلقيح الأولي للعينة التي تستغرق ثلاث ساعات ، مرق ميدلبروك الدافئ وزجاجات ثقافة الأدوات إلى درجة حرارة الغرفة. انقل الوسط من لوحة 12 بئرا إلى الأنابيب المخروطية ذات العلامات المقابلة وأضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل المعقم إلى كل بئر. بعد 10 دقائق ، اكشط الخلايا برفق من البئر باستخدام مكشطة معقمة وادمجها مع الوسط في الأنبوب المخروطي المناسب.
بمجرد غسل البئر ب 0.5 ملليلتر من PBS المعقم ودمجه مع الوسط والتحلل ، قم بكسر الكتل عن طريق تمرير كل عينة برفق من خلال حقنة إبرة قياس 25 ست إلى ثماني مرات. قم بتخفيف العينة في مرق MB بإضافة 900 ميكرولتر من مرق MB إلى 100 ميكرولتر من العينة ، وكرر عملية الحصاد في النقاط الزمنية المطلوبة أثناء الحضانة. قم بإعداد زجاجات مجموعة العدادات عن طريق تعقيم الغطاء المطاطي بنسبة 70٪ كحول.
انقل ما يكفي من المكملات الغذائية لجميع العينات إلى أنبوب مخروطي ، واستخدم إبرة ومحقنة لحقن 0.5 ملليلتر من المكملات الغذائية في زجاجة زراعة الأداة. بعد ذلك ، ماصة 500 ميكرولتر من العينة المخففة واحد في 10 في أنبوب واحد ملليلتر على شكل حرف V. استخدم إبرة ومحقنة لحقن 500 ميكرولتر من العينة في زجاجات ثقافة الأدوات المخصصة.
بعد نقل الزجاجات بعناية من خزانة السلامة الحيوية إلى أداة التحميل ، اضغط على زر التحميل "على نظام الكشف الآلي عن الميكروبات. امسح الرموز الشريطية الموجودة على زجاجات ثقافة الأدوات وضع الزجاجات في حاضنة نظام الكشف عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 42 يوما. قراءة وتسجيل الوقت المستغرق للوصول إلى الإيجابية من شاشة الجهاز وحساب النسبة المئوية TTP.
يشير TTP الإيجابي إلى نمو المتفطرات. راقبت أداة الاستزراع السائل الآلية مستويات ثاني أكسيد الكربون كل 10 دقائق وحسبت TTP ، وهو عدد الأيام من التلقيح حتى يتم وضع علامة على الثقافات على أنها إيجابية. تم توضيح علاقة عكسية بين TTP وقيم log (10) ل CFU في اللقاح الأولي.
عندما تمت مقارنة النمو داخل الخلايا من المتفطرة السلية داخل الضامة التي يحددها تعداد CFU مع طريقة الثقافة الآلية الموصوفة ، تم الحصول على علاقة كبيرة بين النتائج. تم عرض نمو المتفطرة السلية بيانيا من خلال مقارنة قيم TTB لمدة تصل إلى ثمانية أيام بعد الإصابة بالبلاعم إلى قيمة TTP الأولية. أظهر اتجاه مماثل بين CFU والثقافة السائلة تثبيطا كبيرا لنمو المتفطرة السلية في الضامة في وجود حمض الريتينويك المتحولة بالكامل ، أو AtRA ، في المحلول ، أو الجرعة المكافئة من AtRA المغلفة في جسيمات PLGA الدقيقة.
تم إجراء تجربة استجابة الجرعة في خلايا THP-1 المصابة لتحديد فعالية المضاد الحيوي Linezolid وحده ، أو مزيج من linezolid و interferon gamma. لم يلاحظ أي تفاعل كبير بين الأدوية. يسمح لنا تلطيخ AFP باستخدام MOI منخفض لتقليل موت الخلايا عند إصابة البلاعم ، ولضمان استخدام نفس MOI بغض النظر عن العلاج المستخدم.
باتباع هذا البروتوكول ، يمكن تحديد الأدوية المضادة للسل الرئيسية ودراستها بشكل أكبر للتحقق من فعاليتها في الجسم الحي.
