يسمح هذا البروتوكول بإجراء تقييم في المختبر لتأثير الحبس والتصلب المتوسط الذي تتعرض له الخلايا العملاقة الأصلية في نخاع العظم على سلوكها ونضجها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي نموذج مبسط يقضي على التفاعلات بين الخلية والخلية ويركز على الجوانب الميكانيكية. ويجب التقيد بدقة بالممارسات المختبرية الجيدة وظروف العمل العقيمة.
في الواقع ، حتى التلوث الطفيف للهيدروجيل يمكن أن يكون له تأثير كبير على تمايز الخلايا العملاقة. للحصول على بئر واحد من ثقافة الخلايا الهيدروجيل، تبدأ من خلال إذابة اثنين من aliquots ملليلتر واحد من 3٪ ميثيلسليلوز في درجة حرارة الغرفة، ثم معطف واحد ملليلتر لوير قفل حقنة مع ميثيلسليلوز عن طريق رسم أول ملليلتر واحد ومن ثم طرد كل ذلك. بعد ذلك ، باستخدام نفس الحقنة والإبرة ، ارسم 333 ميكرولتر من الميثيلسليلوز من aliquot الطازجة.
بعد إزالة الإبرة بعناية، استخدم ملقط معقم لشد موصل قفل Luer على نهاية الحقنة، ثم قم بتوصيل حقنة قفل ثانية غير مغلفة بمللتر واحد إلى الموصل. توزيع المثيلسليلوز بالتساوي بين المحاقن ووضعها جانبا. بعد ذلك، إعادة إنفاق نسب الماوس المعزول سابقا الخلايا الجذعية والذرية السالبة للدم في وسط الثقافة المركزة بكثافة تبلغ مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل 167 ميكرولتر.
قطع واحدة من المحاقن من الموصل وماصة 167 ميكرولتر من تعليق الخلية مباشرة في الموصل في حين رسم في وقت واحد المكبس حقنة ببطء لإفساح المجال لتعليق الخلية. بعد إضافة كل تعليق الخلية في الموصل، ارسم المكبس لسحب التعليق من الموصل وأعد توصيل الحقنة الثانية بعناية، مع الحرص على عدم فقدان أي تعليق في الخيط المسماري. لتجانس وسيط ميثيلسليلوز مع تعليق الخلية ، قم بتحريك المكبس ببطء ذهابا وإيابا بين الحقنتين 10 مرات ، ثم ارسم الحجم الإجمالي في حقنة واحدة وفصل المحاقن ، تاركا الموصل على الحقنة الفارغة.
إفراغ محتويات المحقنة في بئر واحد من لوحة من أربعة آبار واحتضان لوحة في 37 درجة تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتحليل الألواح، في اليوم الثالث من الثقافة، نقل بعناية جميع الخلايا من بئر واحد إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من DMEM مع 1٪PSG. Resuspend الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف لتمييع تماما ميثيلسليلوز، ثم الطرد المركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق في 300 مرة G في درجة حرارة الغرفة.
بعد التخلص من supernatant، resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من متوسطة الثقافة الكاملة وإعادة البذور الخلايا في 500 ميكرولتر لكل بئر من لوحة أربعة آبار. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، باستخدام مجهر برايتفيلد مع هدف 20X ، والحصول على عشوائيا 10 صور لكل بئر ، مع التأكد من عدم وجود خلايا كثيرة جدا في مجال الرؤية والتقاط ما لا يقل عن خمسة megakaryocytes لكل حقل.
باستخدام ImageJ، عد العدد الإجمالي للخلايا الضخمة وتلك التي تمتد البربليتليت في كل صورة لحساب نسبة الخلايا العملاقة تمديد الصفائح. لإصلاح الخلايا للتحليلات المستقبلية، أضف المحلول المثبت فوق الميثيلسليلوز دون تعطيل الجل. بعد الانتظار لوقت مناسب اعتمادا على المثبتة المستخدمة، استخدم ماصة P1000 إلى ماصة بلطف المثبت وهلام حتى تم تخفيف ميثيلسليلوز متجانسة.
وباستخدام نفس تلميح ماصة، نقل جميع محتويات البئر إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من DPBS وتجانس عن طريق الاختلاط. الطرد المركزي الخليط. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه megakaryocyte في وسيلة مناسبة للتحليل المطلوب.
بحلول اليوم الثالث من الثقافة ، رسوبيت الخلايا العملاقة في الوسط السائل في الجزء السفلي من البئر وهي على اتصال مع السطح البلاستيكي الصلب ، وكذلك الخلايا الأخرى. في المقابل، يتم توزيع الخلايا المضمنة في هيدروجيل ميثيلسليلوز بشكل متجانس ومعزولة عن الخلايا المجاورة. تحليل القطر المتوسط للخلايا الضخمة في ظل ظروف ثقافية مختلفة يظهر أن 2٪ ميثيلسليلوز يزيد قليلا من متوسط قطر الخلايا العملاقة مقارنة بالثقافة السائلة.
ومع ذلك، فإن زيادة تركيز الميثيلسليلوز بنسبة 0.5٪ يضعف التمايز megakaryocyte كما هو مبين من قبل أصغر متوسط القطر. في الصور المجهرية الإلكترونية الإرسال التمثيلي، يبدو أن الأغشية داخل السيتوبلازمية في الخلايا الضخمة المتمايزة في الجسم الحي داخل نخاع العظام تعارض بشكل وثيق مع الأراضي السيتوبلازمية المحددة. في الثقافة السائلة ، يكون للأغشية في الغالب مظهر بيضاوي مستدير صغير أو حويصلات ممدودة دون تحديد الأراضي السيتوبلازمية.
في المقابل ، عارضت ثقافة الميثيلسليلوز 2٪ الأغشية بشكل وثيق مع تحديد الأراضي السيتوبلازمية التي تشبه الهيكل في الموقع. بحلول اليوم الرابع من الثقافة ، تظهر الخلايا الضخمة التي كانت مثقفة سابقا في الهيدروجيل زيادة تكوين البربليتليت مقارنة بتلك المستزرعة في الوسط السائل. متوسط نسبة الخلايا الضخمة تمديد proplatelets عادة حوالي 15 إلى 20٪ مع السائل قبل الثقافة مقارنة مع 35 إلى 40٪ مع هيدروجيل ميثيلسليلوز قبل الثقافة.
عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن ماصة المجلدات المناسبة بدقة شديدة كما تغيير طفيف في تركيز ميثيلسليلوز النهائي يمكن أن تعدل بشكل كبير صلابة وسائل الإعلام. بعد نضوج الخلية في الهيدروجيل ، يمكن استرداد الخلايا الضخمة لتحليل ploidy وعلامة الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي أو إصلاحها للفحص المجهري الإلكتروني أو التصبغ المناعي للبروتين المثير للاهتمام.
