يعد اللونيات استبعاد الحجم نهجا مفيدا لفصل الفئات السكانية الفرعية للحوائش البكتيرية غير المتجانسة الحجم وإزالة الأحماض النووية والبروتينات من المضادات البكتيرية. يعد اللونيات استبعاد الحجم أقل تكلفة وأسرع وأكثر قابلية للاستنساخ من تقنيات الفصل الأخرى، بما في ذلك الطرد الفائق الانحدار للكثافة. لقد أظهرنا إمكانات هذا النهج باستخدام الحويصلات A.actinomycetemcomitans ، لكننا نتوقع أنه يمكن تطبيقه على مجموعات الحويصلات البكتيرية الأخرى غير المتجانسة الحجم أيضا.
تأكد من أن degas بشكل صحيح كل من العازلة وحلول حبة وماصة الحل ببطء دون إدخال فقاعات ولكن بسرعة كافية أن حزمة الخرز متجانسة دون تجفيف. للبدء، استخدم قضيب زجاجي لخلط زجاجة مخزون من هلام الترشيح المتوسطة وصب حجم المطلوبة لملء العمود بالإضافة إلى ما يقرب من 50٪ الزائدة في زجاجة. السماح للخرز لتسوية وdecant السائل الزائد.
Resuspend الخرز في العازلة elution إلى حل نهائي من هلام ما يقرب من 70 ٪ و 30 ٪ العازلة وdgas الحل تحت فراغ. قم بتركيب العمود على حامل حلقة في الموضع الرأسي وملء العمود بحاجز elution لتبلل الجدران قبل استنزاف المخزن المؤقت حتى يبقى سنتيمتر واحد فقط. ثم ماصة بعناية الخرز هلام في العمود في حين استنزاف في وقت واحد العازلة الزائدة لمنع الخرز من الاستقرار حتى يتم تعبئة العمود إلى ارتفاع سنتيمترين تقريبا تحت الجزء السفلي من خزان العمود.
قبل تحميل العينة، ديغا العازلة elution تحت فراغ. اغسل العمود بحوالي ضعف حجم العمود من المخزن المؤقت elution. بمجرد أن يصل العازلة إلى أعلى طبقة هلام، إضافة بعناية اثنين من ملليلتر من 100 إلى 200 نانومولار لكل لتر عينة الحويصلة الغشاء الخارجي على رأس طبقة هلام دون إزعاج السطح والسماح للعينة دخول هلام.
أضف المخزن المؤقت elution ببطء إلى العمود دون إزعاج طبقة الجل وضع أنبوب 50 ملليلتر تحت العمود. لمنع تجفيف العمود، قم في نفس الوقت بإضافة المخزن المؤقت elution إلى أعلى العمود. بعد جمع 20 ملليلتر من اليواتي، ضع رف من أنابيب 1.5 ملليلتر تحت العمود.
جمع ما مجموعه 96 كسر ملليلتر واحد في كل أنبوب. أثناء تجميع العينات، قم بإضافة المخزن المؤقت elution باستمرار إلى العمود. لتنظيف العمود، قم بتشغيل حجم عمود واحد من هيدروكسيد الصوديوم المولاري 0.1 من خلال العمود متبوعا بمجلدات عمودين من المخزن المؤقت elution.
لقياس تركيزات الدهون، ماصة 50 ميكرولتر من كل جزء في لوحة بئر 96. إضافة 2.5 ميكرولتر من صبغة الدهون إلى كل بئر. بعد 15 ثانية، قياس كثافة فلوريسنس.
لقياس تركيز البروتين ذات الأهمية، أضف 100 ميكرولتر من كل جزء إلى آبار فردية من لوحة المناعة ELISA. بعد ثلاث ساعات في 25 درجة مئوية، decant محتويات لوحة. غسل لوحة خمس مرات مع 200 ميكرولتر من العازلة غسل ELISA لكل غسل decanting لوحة بعد كل غسل.
إضافة 200 ميكرولتر من العازلة حجب إلى كل بئر لمدة ساعة واحدة حضانة في 25 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، قم بفك الصفيحة وأضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في حاجز الحجب لاحتضانها بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، decant لوحة وغسل لوحة خمس مرات مع العازلة غسل ELISA كما هو موضح.
بعد الغسيل الأخير، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في عازل غسل ELISA إلى كل بئر لمدة ساعة حضانة عند 25 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، اغسل اللوحة كما هو موضح وأضف 100 ميكرولتر من محلول TMB لكل بئر لمدة 15 إلى 30 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة. عندما يتطور اللون الأزرق، إضافة 50 ميكرولتر من محلول وقف لكل بئر وقياس امتصاص في 450 نانومتر.
بعد حجم استبعاد العمود تنقية A.actinomycetemcomitans الثقافة supernatant كما هو موضح، لوحظت اثنين من قمم الدهون متميزة، المقابلة ل vesicles الغشاء الخارجي الكبيرة والصغيرة التي تنتجها هذه السلالة. كشف تحليل ELISA لكسور العينة أن السم يرتبط في المقام الأول بالسكان الفرعيين ل الحويصلات الكبيرة للغشاء الخارجي. أعطى تحليل البقع المناعية نتائج مماثلة ولكن أكثر ضجيجا ، مما يشير إلى أن هذا النهج أقل حساسية من ELISA.
كما لوحظ، هذه التقنية الكروماتوغرافيا قادرة على إزالة كميات كبيرة من البروتينات الحرة من الاستعدادات الحويصلات الغشاء الخارجي. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن تركيز البروتين الكلي لا يرتبط بالضرورة مع تركيز بروتينات محددة. من المهم أن نكون حذرين جدا أثناء التعبئة وتشغيل العمود لتجنب الفقاعات ومنع العمود من الجفاف.
يمكن إجراء تشتت الضوء الديناميكي وتتبع الجسيمات والتنظير الثنائي بعد كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لتحديد حجم وخصائص أخرى من الحويصلات الغشاء الخارجي المنفصل.
