هذا البروتوكول الاستخراج الحمض النووي الصديقة للميزانية المغناطيسية القائمة على حبة يجعل تسلسل الإنتاجية العالية في متناول مختبرات الموارد المحدودة والدراسات. لا يتطلب هذا البروتوكول معدات باهظة الثمن لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة ويمكن أن يكون مفيدا في بعض الحالات التشخيصية أو البحثية حيث يكون الحصول على كمية كافية من الحمض النووي بجودة عالية لتسلسل الإنتاجية أمرا صعبا. هذا البروتوكول سهل النسخ المتماثل مع عرض توضيحي لمرة واحدة.
يجب أن يتم تجربتها مع عدد صغير من العينات أولا للتعرف على سير العمل. للبدء، هيدرات عينات أنسجة البعوض المخزنة في الكحول أكثر من 70٪عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من المياه الصف PCR واحتضان لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية لتنعيم الأنسجة. بعد الحضانة، تجاهل الماء وإضافة 100 ميكرولتر من بروتيناز K مزيج الانزيم العازلة.
ثم استخدم أنبوب الطرد الدقيق pestle لتجانس الأنسجة. بعد التجانس، والطرد المركزي الأنسجة lysate واحتضان لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في 56 درجة مئوية. لاستخراج الحمض النووي، ماصة 100 ميكرولتر من الأنسجة lysate في أنبوب جديد الطرد الدقيق نظيفة.
ثم أضف 215 ميكرولتر من مزيج حبة مغناطيسية رئيسية. باستخدام ماصة، اخلطي خليط اليزيت والخرز المغناطيسي لمدة 10 إلى 20 ثانية، ثم اتركيه يقف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، هز الأنبوب برفق أحيانا لزيادة ربط الحمض النووي بالخرز المغناطيسي.
بعد ذلك ، ضع الأنبوب على فاصل الخرز المغناطيسي حتى يصبح الحل واضحا. ثم باستخدام ماصة، يستنشق السائل بلطف من الأنبوب دون إزعاج الخرز المغناطيسي عقد الحمض النووي. نقل أنبوب بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وغسل الخرز بإضافة 325 ميكرولتر من العازلة غسل واحد.
تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، ضع الأنبوب على فاصل الخرز المغناطيسي وأزل النافورة كما هو موضح سابقا ، ثم حرك الأنبوب بعيدا عن فاصل الخرز المغناطيسي واغسل الخرز مرة واحدة مع غسل العازلة. بعد غسل الثاني مع العازلة واحدة، وغسل الخرز مرتين مع 250 ميكرولتر من العازلة الغسيل اثنين بنفس الطريقة.
بعد الغسيل الأخير، حرك الأنبوب بعيدا عن فاصل الخرز المغناطيسي وأضف 100 ميكرولتر من العازلة elution. تخلط جيدا عن طريق pipetting ثم احتضان الأنبوب لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة قبل وضعه مرة أخرى على فاصل المغناطيسي. عندما يصبح الحل واضحا، قم بنقل المسخ الفائق إلى أنبوب طرد دقيق جديد ونظيف 0.5 ملليلتر وتخزينه بشكل مناسب.
يظهر هنا كقراءة نموذجية لمقياس الفلورومتر الدقيق للحمض النووي للبعوض في مخزن مؤقت elution يحتوي على 0.5 ملليمولار EDTA. متوسط 260 إلى 280 نانومتر نسبة الامتصاص هو 2.3. يوضح هذا الجدول التكاليف وعدد العينات التي تمت معالجتها في يوم عمل واحد لطرق استخراج مختلفة.
الكواشف النموذجية والتكلفة الاستهلاكية لاستخراج بواسطة هذا البروتوكول حوالي 9.50 لكل عينة. هذه التكلفة تعادل أي طريقة استخراج نموذجية قائمة على حبة مغناطيسية. تأتي الفائدة الرئيسية من تكلفة هذا البروتوكول من عدم الحاجة إلى أداة استخراج الحمض النووي الآلية.
تأكد من تغيير نصائح ماصة بين العينات لمنع التلوث المتبادل للحمض النووي عند العمل مع عينات متعددة. نحن نستخدم الحمض النووي عالي الجودة المستخرج باستخدام هذه الطريقة لتسلسل الجينوم بأكمله. ونحن نستخدم حاليا بيانات التسلسل لتحديد الطفرات الجديدة في مقاومة المبيدات الحشرية أو الجينات المناعية التي تثير القلق في مجال الصحة العامة ومكافحة الأمراض.
إن وجود حلول بأسعار معقولة لتسلسل الإنتاجية العالية يفتح أبوابا مثيرة لعلم الجينوم السكاني وعلم الجينوم الطبيعي الذي يهدف إلى فهم تشتت البعوض وتدفق الجينات مما يؤثر على نجاح العديد من استراتيجيات التحكم الجيني الجديدة.
