الكشف عن الجليكوسامينوغليكان بواسطة البولي أكريلاميد جل إلكتروفورسيس وتلطيخ الفضة

يصف هذا البروتوكول تقنية بسيطة يمكن استخدامها للكشف عن وجود وقياس طول الجليكوسامينوغليكان، وهي جزيئات ذات أهمية متزايدة للعديد من العمليات البيولوجية. هذه التقنية قابلة للتكيف بسهولة مع معظم مختبرات علوم الحياة. تقنيات الجليكومية المقارنة غالبا ما تتطلب المعدات والخبرات الموجودة فقط في مختبرات أبحاث الكيمياء الجليكوكيميائية.

قد تكون هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للباحثين المهتمين بدراسة الجليكوكاليك، وهو معطف متعدد السكريات يبطن السطوح البطانية والظهارية لجسم الإنسان. ابدأ بوضع كاسيت فارغ في خزان PAGE. يلقي هلام حل عن طريق خلط 10 ملليلتر من حل هلام مع 60 ميكرولتر من أعدت حديثا في 10٪ بيرسولفيت الأمونيوم في أنبوب 15 ملليلتر.

ثم أضف 10 ميكرولترات من TEMED. عكس الأنبوب بلطف مرتين إلى ثلاث مرات. أضف بسرعة 10 ملليلترات من محلول هلام البولي أكريلاميد المنشط إلى الكاسيت باستخدام ماصة.

تراكب مع اثنين من ملليلتر من المياه المصفاة deionized، والسماح للهلام حل لبوليمرة لمدة 30 دقيقة. بعد أن يبوليمر الجل الحل بالكامل ، تجاهل الماء المتراكب. يلقي هلام التراص عن طريق خلط ثلاثة ملليلتر من محلول هلام التراص مع 90 ميكرولتر من persulfate الأمونيوم المعدة حديثا 10٪ في أنبوب 15 ملليلتر.

ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من TEMED وعكس الأنبوب بلطف مرتين إلى ثلاث مرات. استخدام ماصة لإضافة بسرعة حل هلام التراص على هلام حل صلبة حتى يتم تعبئة كاسيت إلى حافة. إدراج تماما المشط المدرجة مع كاسيت هلام البولي أكريلاميد فارغة والسماح للهلام التراص لبوليميراز لمدة 30 دقيقة.

بمجرد أن يتم بلمرة الجل ، قم بإزالة شريط الشريط من أسفل الكاسيت ، ووضع الكاسيت مرة أخرى في تجميع خزان PAGE. املأ الغرف العلوية والسفلية بحلول المخزن المؤقت المعنية. حل عينات الجليكوسامينوغليكان المجففة في الحد الأدنى من الحجم اللازم من المياه المصفاة deionized وخلط مع عينة تحميل العازلة في نسبة واحد إلى واحد.

تحميل العينات وسلالم Oligosaccharide HS في هلام. قم بتشغيل الجل لمدة خمس دقائق عند 100 فولت، ثم قم بتشغيله عند 200 فولت لمدة 20 إلى 100 دقيقة، اعتمادا على نسبة الأكريلاميد من محلول الجل الحل. بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بتفكيك الكاسيت واستخراج الجل بعناية في حاوية نظيفة كبيرة مليئة بالماء المصفاة deionized.

ثم تجاهل الماء وصمة عار الجل في محلول تلطيخ الأزرق Alcian لمدة خمس دقائق. تجاهل البقعة الزرقاء الألسيان، ويغسل بسرعة مرتين إلى ثلاث مرات مع المياه المصفاة deionized حتى تمت إزالة معظم محلول تلطيخ الأزرق Alcian. لطخ الجل في محلول تلطيخ نترات الفضة في وعاء نظيف طازج لمدة 30 دقيقة.

ثم يغسل مرتين إلى ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما في المياه المصفاة deionized لإزالة تماما محلول تلطيخ الفضة. تجاهل الماء وإضافة حل النامية. مراقبة بعناية هلام لظهور العصابات.

اعتمادا على نوعية وصمة عار وكتلة العينة المحملة، يمكن أن يستغرق التطوير في أي مكان من بضع ثوان إلى عدة دقائق. بمجرد أن تكون العصابات المطلوبة مرئية ، تجاهل على الفور الحل النامي وغسل الجل لفترة وجيزة مع حل STOP. تم تصور الجليكوسامينوغليكان المعزولة والمنقورة باستخدام تقنية تلطيخ الأزرق والفضة الألسيان بعد دقة تعتمد على الكثافة بواسطة إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد.

كما رأينا في هذا الشكل، كانت كبريتات الهيباران oligosaccharides من أطوال البوليمر المختلفة يمكن الكشف عنها بسهولة باستخدام هذا النهج القائم على PAGE. ويبين الحد الأقصى للكشف عن هذه الطريقة، التي لا تبلغ 0.5 ميكروغرام، أن هذه التقنية حساسة للغاية في الكشف عن الجليكوسامينوغليكان المعزولة والمطهرة من العينات البيولوجية. من بين أربعة من كبريتات الهيبارين المختلفة التي تصورها أوليغوساكاريد باستخدام هذه الطريقة، كان الهيبارين غير المفرخ أقل قابلية للكشف بسهولة.

نظرا لتعدد أضلاع الهيبارين غير المفرخ ، فإن كثافة كل نطاق فردي من هذه العينة أقل من النطاقات التي تنتجها كتلة متساوية من أوليغوساكاريد الهيبارين النقي. تم تقييم كفاءة تنقية الجليكوسامينوغليكان من العينات البيولوجية السائلة باستخدام عينات الحمم الهوائية التي تم جمعها من الفئران ، والتي كانت تحتوي في الأصل على تركيزات منخفضة نسبيا من الجليكوسامينوغليكان. بالإضافة إلى ذلك ، تم إثبات نجاح هذه التقنية باستخدام كبريتات الهيبارين المعزولة عن متجانسة الرئة بأكملها ، والتي أسفرت عن كمية وافرة من كبريتات الهيبارين المعزولة ، مع أصغر الشظايا تساوي حوالي 10 وحدات فرعية من التفكيك في الكتلة.

من المهم جدا استخدام الكواشف الطازجة، وتصفية كل كاشف يستخدم في هذا البروتوكول. من المهم استخدام الكواشف ذات أعلى درجة من النقاء والجودة لتنفيذ هذه التقنية بنجاح.