ويمثل الحفاظ على إمكانية بقاء البويضات بعد التخزين على المدى الطويل أداة لفرصة عظيمة، لأنه من شأنه أن يحسن تربية الحيوانات المنزلية من خلال برامج الانتقاء الجيني، ويساهم في الحفاظ على التنوع البيولوجي من خلال الحفاظ على أنواع الحياة البرية، ويزيد من البحوث في مجال التكنولوجيا الحيوية. كان تزجيج البويضات الأحداث أقصر بكثير في فترة الجيل في برامج التربية. يعتبر Vitrifaction عن طريق التبريد والاحترار ultrarapid نهجا قياسيا في الحفاظ على البويضات الماشية.
ومع ذلك، في الأغنام هذا الإجراء لا يزال يعتبر جديدا نسبيا، وهناك نقص في طريقة قياسية. في هذا الفيديو، نقوم بوصف بروتوكول لتزجيج البويضات الخرافية، التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين على حد سواء، وفي المختبر نضجت إلى ما قبل التبريد. يتضمن البروتوكول جميع الإجراءات من النضج في المختبر ، والتزجيج ، والاحترار ، وثقافة ما بعد الاحترار.
بعد استعادة مجمع البويضات الركامية ، حيث نضجت في المختبر لمدة 24 ساعة في حالة ثابتة تشمل البويضات الأحداث ، والتكميل مع مائة ميكرومولار من تريهالوز في وسط النضج. بعد النضج في المختبر ، تم تجني البويضات من خلايا Cumulus ميكانيكيا عن طريق الأنابيب بلطف وفحصها تحت المجهر ستيريو ، مع تكبير 60x. اختيار البويضات لتقديم في إجراءات التزجيج تمثل الخطوة الهامة الأولى لضمان التطبيق الناجح لهذا الإجراء.
فقط تلك مع السيتوبلازم موحدة، مع توزيع متجانسة من قطرات الدهون، وسلامة كل إيما واسعة ومحورية مستمرة في الفضاء، زونا بيلوسيدا المدمجة القطر الخارجي من حوالي 19 ميكرومتر وإظهار البثق من الجسم القطبي الأول، وبالتالي في M2، يجب اختيار المرحلة. تم إجراء التزجيج باستخدام الحد الأدنى من طريقة الحجم الأساسية ، مع جهاز Cryotops. بعد الاختيار، تم تكييف مجموعة من خمس بويضات الأحداث في 38.5 درجة مئوية في الوسط الأساسي لمدة دقيقتين.
ثم تم جفاف البويضات من قبل ثلاث دقائق التعرض لمحلول المعايرة. تحميل البويضات في جهاز التزجيج المستخدمة هو خطوة هامة وحاسمة. يستخدم Cryotop شريط البولي بروبلين المرفق بحامل.
في هذه الطريقة ، يتم تحميل البويضات في محلول التزجيج ، أقل من 0 ملليلتر نقطة بسرعة مع شعرية زجاجية فوق شريط الفيلم. ثم يجب إزالة الحل، تاركا وراءه طبقة رقيقة بما يكفي لتغطية الخلايا لتكون cryopreserved. قبل تحميلها في جهاز Cryotop وسقطت مباشرة في النيتروجين السائل في غضون 30 ثانية.
بالنسبة لدرجة الحرارة البيولوجية الداخلية الدافئة ، تم نقل محتوى كل جهاز تزجيج من النيتروجين السائل إلى 200 قطرة ميكرولتر من محلول تريهالوز المتناقص. تم نقل البويضات مجموعة، وسحب البويضات مع رقيقة، ماصة زجاجية، لتعزيز إزالة cryoprotectants داخل الساقين. وأخيرا، كانت البويضات تولد مسبقا في وسط أساسي في حاضنة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
مباشرة بعد الاحترار، ولكل نقطة زمنية من ثقافة ما بعد الاحترار، تم تقييم البويضات بشكل مورفولوجي باستخدام مجهر مقلوب مع تكبير 100x. التسامح cryo من البويضات من المتبرعين الأحداث أقل بالمقارنة مع تلك المعدلة مع انخفاض سلامة الغشاء بعد الاحترار. استخدام تريهالوز في المتوسط النضج الناجم في البويضات الأحداث أعلى سلامة الغشاء، وزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد التزجيج.
ومع ذلك لم يتم زيادة الانقسام والإخصاب ومعدلات النمو للخلايا البويضات الأحداث عن طريق مكملات تريهالوز. استخدام وسائل الإعلام مع تركيز الكالسيوم يساوي 2.2 ملليغرام ديسيلتر لتزجيج البويضات الأحداث، ينبغي أن معدلات الإخصاب أعلى مقارنة مع البويضات تهتز مع تركيز الكالسيوم، ولكن لم يتم العثور على اختلافات تمكين الإنتاج. من خلال مقارنة ثقافة ما بعد الاحترار على فترات مختلفة ، أظهرنا أنه بعد أربع ساعات من البويضات الثقافية التي تم جمعها من اثنين أكبر سنا قادرون على استعادة الروابط النشطة والإعداد المجهري ، واستعادة الكفاءة التنموية مع ارتفاع الانقسام ونفايات الخلايا الانفجارية.
كان نشاط الميتوكوندريا أعلى في البويضات الدافئة الزخورة بعد أربع ساعات من ثقافة ما بعد الاحترار ، مقارنة بالنقاط الزمنية الأخرى. كما تغير فراق توزيع الميتوكوندريا خلال ست ساعات من ثقافة ما بعد الاحترار. وعلاوة على ذلك، كانت مستويات الأكسجين التفاعلي داخل الخلايا أقل بكثير في البويضات الأحداث في ساعتين من ثقافة ما بعد الاحترار مقارنة مع 0 و 4 و 6 ساعات.
ومع ذلك ، وعلى النقيض مما وجد في البويضات الأخرى ، زادت معدلات التنشيط الذاتي البارثينوجيني خلال ثقافة ما بعد الاحترار في البويضات الأحداث. واحدة من المزايا الرئيسية للطريقة المقترحة هي أنها تشمل جميع الخطوات من جمع البويضات إلى النضج في المختبر ، والتزجيج ، والاحترار. وعلاوة على ذلك فإنه يتضمن فترة ثقافة ما بعد الاحترار للسماح باستعادة البويضات من الأضرار التي لحقت أثناء إجراء التزجيج.
اختيار الوقت الأمثل للإخصاب أمر صعب، وقد يؤثر على نتيجة برنامج التزجيج. وينبغي أيضا اعتبار أن التزجيج، خلافا لبطء التجميد، تقنية يدوية، وبالتالي فهو يعتمد على المشغل. ولهذا السبب، يتمثل أحد التحديات الرئيسية في الحاجة إلى فنيين وباحثين مهرة يأخذون في الاعتبار تأثير المشغل في تقييم نتائج برنامج التزجيج.
المزيد من الدراسات من مختبرنا سوف تسمح في محاولة لتوحيد إجراء التزجيج البويضات والاختيار، وفي تحسين تصميم وسائل الإعلام التكوين لاحتياجات البويضات الأحداث. تجاهل حول استخدام الثقافة والشخصية ومضادات الأكسدة نقدم فرصا واعدة.
