سيمكن هذا البروتوكول من استخدام الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد النمط الظاهري الأولي. وعندما يقترن ب ATAC-seq أحادي الخلية ، فإن إعادة بناء الشبكات التنظيمية الجينية. إن استخدام MULTI-seq يبقي التكاليف منخفضة للتحقيق الأولي ، ويسمح تحديد العينات المقترنة ل RNA-seq أحادي الخلية و ATAC-seq أحادي الخلية بتحليل المسار الزمني للشبكات التنظيمية الجينية.
يمكن للمحققين استخدام هذا البروتوكول لفهم الشبكات الجينية التي تتحكم في التطور وتطور المرض. للبدء ، أضف 20 ميكرولتر من محلول الباركود المرساة إلى كل عينة وماصة لمزجها. احتضنه على الجليد لمدة خمس دقائق.
ثم أضف 20 ميكرولتر من محلول الإرساء المشترك إلى كل عينة، واحتضنها على الثلج لمدة خمس دقائق أخرى. أضف ملليلتر واحد من الثلج البارد 1٪ BSA و PBS إلى كل عينة وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. إزالة supernatant دون إزعاج بيليه الخلية.
ثم أضف 400 ميكرولتر من الثلج البارد 1٪ BSA و PBS. جهاز طرد مركزي عند 300 × g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تحديد تركيز الخلايا لكل عينة باستخدام مقياس الدم ، وحساب العدد الإجمالي للخلايا والحجم المطلوب لمستحلب جل الخرزة أو GEM.
اجمع الأحجام المحسوبة من كل عينة في أنبوب جديد معقم بسعة 1.5 ملليلتر، وحدد تركيز الخلية النهائي للعينات المدمجة. بعد توليد GEM والترميز الشريطي ، قم بإجراء تنظيف cDNA للتعبير الجيني باستخدام تحديد الحجم ، مع التأكد من عدم التخلص من supernatant من الجولة الأولى من الاختيار ، والتي تحتوي على الباركود العينة. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد معقم 1.5 ملليلتر وقم بتخزينه على الجليد.
دوامة كاشف اختيار الحجم القائم على الخرز شبه المغناطيسي ، وإضافة 260 ميكرولتر من الكاشف و 180 ميكرولتر من 100٪ Isopropanol إلى supernatant. ماصة المزيج 10 مرات وحضانت في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي وانتظر حتى يمسح الحل.
بمجرد أن يصبح الحل واضحا ، قم بإزالة وتجاهل supernatant. أضف 500 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول إلى الخرز لمدة 30 ثانية ، ثم تخلص من supernatant. كرر هذا لما مجموعه غسلتين.
الطرد المركزي لفترة وجيزة الخرز وإعادتها إلى الرف المغناطيسي. اضبط المؤقت على دقيقتين. ثم قم بإزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة P10 ، وجفف الخرز في الهواء على الرف المغناطيسي لمدة دقيقتين متبقيتين.
قم بإزالة الخرز من الرف المغناطيسي وأعد تعليقه في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت. ماصة تماما للإنعاش ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ، ثم إعادة الخرز إلى الرف المغناطيسي وانتظر حتى يزول المحلول. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر.
كرر التنظيف كما هو موضح ، باستخدام نصف حجم المخزن المؤقت للاستخراج. بالنسبة للعينات الموجهة لتسلسل scATAC ، قم بإزالة أي سائل من أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام ماصة P200 ، وقم بتجميد العينات في الثلج الجاف للإيثانول. لفصل الخلايا في العينات المخصصة لتسلسل scRNA ، قم بتنفيذ خطوات التفكك باستخدام غراء ، كما هو موضح في مخطوطة النص.
قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × g لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة supernatant دون تعطيل بيليه الخلية. أضف ملليلتر واحد من PBS المبرد ، واخلطه 10 مرات أو حتى يتم تعليق الخلايا تماما. مرة أخرى ، جهاز طرد مركزي عند 300 × g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وكرر الغسيل مع PBS مرتين.
ابدأ في دوامة الأنبوب عند إعداد أدنى سرعة وأضف 900 ميكرولتر من الميثانول المبرد ، قطرة قطرة ، مع الاستمرار في دوامة الأنبوب بلطف لمنع الخلايا من التكتل. احتضن الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة. تحديد تركيز الخلايا الثابتة باستخدام مقياس الدم ، وتقييم فعالية خطوة التثبيت باستخدام التربان الأزرق.
تخزين الأنسجة المجمدة والخلايا الثابتة في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. يتيح الترميز الشريطي لتسلسل MULTI التسلسل المشترك لعينات متعددة وفك الالتفاف الحسابي اللاحق. يمكن تحديد عينة المنشأ لكل خلية بناء على تعبير الباركود الخاص بها.
يمكن تحليل هذه العينات المدمجة كمجموعة بيانات واحدة لأغراض تجميع الخلايا وتحديد نوع الخلية. نظرا لأن كل خلية يتم ترميزها بالباركود قبل إنشاء GEM ، سيكون لثنائيات الخلايا احتمال كبير لإظهار التعبير عن الرموز الشريطية متعددة تسلسل MULTI ، وبالتالي يمكن تحديد غالبية الثنائيات وإزالتها قبل التجميع وتحديد نوع الخلية. يمكن استخدام تسلسل ATAC أحادي الخلية لإنشاء مجموعة بيانات مع أنواع الخلايا لمطابقة تلك الموجودة بواسطة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
إن الاقتران بين التعبير الجيني لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ومعلومات الوصول إلى الحمض النووي لتسلسل ATAC أحادي الخلية يتيح إعادة بناء الشبكات التنظيمية الجينية. عند محاولة البروتوكول ، ضع في اعتبارك أن توقيت التبخر العرقي لمدة دقيقتين أمر بالغ الأهمية لاسترجاع التسلسل في خطوات الاستخلاص اللاحقة. إن إعادة بناء الشبكات التنظيمية الجينية باستخدام الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المقترن و ATAC-seq أحادي الخلية ينتج أهدافا للتعبير المفرط عن الجينات ودراسات الضربة القاضية.
يمكن استخدام MULTI-seq في هذه المرحلة لتحديد التأثيرات الخاصة بنوع الخلية.
