من الصعب تقييم وظيفة الساركومير في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات بسبب ساركوميرها المتخلف وغير المنظم. باستخدام بروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت، يمكننا الآن الوصول إلى تقصير الساركومير. يمكننا تصور الساركومير وتقييم وظيفتها في المختبر باستخدام خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية وبروتينات الساركومير الموسومة بالفلورسنت.
باستخدام النقل القائم على AAV ، يمكننا توسيع الطريقة إلى أي خلايا جذعية مستحثة مشتقة من المريض. يمكن توسيع هذه الطريقة لتطوير علاج اعتلال عضلة القلب ، حيث يمكن استخدامها لتقييم خلل الساركومير المرتبط بالأمراض مباشرة في المختبر. هذه الطريقة مفيدة في مجال أمراض القلب، بما في ذلك دراسة أمراض القلب للأطفال.
ومع ذلك، فإنه يمكن أيضا تطبيقها على دراسة خلل العضلات الهيكل العظمي، مثل اعتلال عضلي. في اليوم ناقص أربعة من التعريفي التمايز، معطف لوحة من ستة آبار مع 0.5 ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع من صفيحة-511 E8 المخفف في برنامج تلفزيوني لاحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قرب نهاية الحضانة، علاج الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان مع تريبسين المؤتلف لمدة ثلاث دقائق في 37 درجة مئوية.
عندما تكون الخلايا قد انفصلت، حصاد الخلايا إلى متوسطة تكملها 10٪ FBS للعد، وإعادة إنفاق الخلايا في 1.25 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل اثنين من ملليلتر من AK02N المتوسطة تكملها مغلفة 511 E8 وروك المثبط بعد الطرد المركزي. بعد ذلك ، يستنشق محلول الطلاء من كل بئر من لوحة ستة آبار ، وبذور اثنين من ملليلتر من الخلايا في كل بئر. أعد الطبق إلى حاضنة ثقافة الخلية.
بعد أربعة أيام، تصل الخلايا إلى التقاء 80٪. استبدال supernatant في كل بئر مع اثنين من ملليلتر من RPMI بالإضافة إلى B27 دون الأنسولين المتوسطة تكملها GSK-3 المانع لكل بئر للحث على التمايز. بعد يومين من التمايز، استبدال بلطف المتوسطة مع اثنين من ملليلتر من RPMI بالإضافة إلى B27 دون الأنسولين المتوسطة تكملها مثبط القنفذ لكل بئر.
الخلايا يجب أن تصل إلى التقاء 100٪. في اليوم الرابع من التمايز ، استبدل المضادات الفائقة بلطف بميليلترين من RPMI بالإضافة إلى B27 بدون الأنسولين لكل بئر. يجب أن تبقى الخلايا في كثافة عالية، وبعضها قد بدأت تطفو.
في اليوم السابع والتاسع من التمايز ، استبدل الفائق في كل بئر بميليلترين من RPMI بالإضافة إلى B27 بالإنسولين المكمل بالبوروميسين لثقافة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية الانتقائية متعددة القدرات. عند هذه النقطة، ينبغي ملاحظة ضرب الخلايا داخل الثقافات. لإعداد ثقافة خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المنقوشة ، استخدم أولا شريط إصلاح لإزالة أي غبار من سطح طابع PDMS المصنوع خصيصا ، وغمر الطابع لفترة وجيزة في الإيثانول بنسبة 70٪.
استخدام منفضة الهواء لإزالة الإيثانول من سطح الطابع، ومعالجة السطح مع خمسة إلى 10 ميكرولتر من البوليمر MPC 0.5٪ والإيثانول. عندما يجف البوليمر تماما، ضع الختم على غطاء بوليمر في طبق تصوير 35 ملليمترا، وضع وزنا على الطابع. بعد 10 دقائق، استخدم المجهر الخفيف للتأكد من أن النمط قد تم نقله إلى غطاء الغطاء، وغسل الطبق والأغطية مرتين مع PBS.
بعد الغسيل الثاني، قم بتغطية الغطاء ب 0.5 إلى ميكروغرام واحد لكل سنتيمتر مربع من اللامينين-511 E8 المخفف في الجيلاتين بنسبة 0.1٪ لاحتضان لمدة ساعتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. في اليوم 10 من التمايز، اغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، يليه العلاج مع ملليلتر واحد من التريبسين المؤتلف لكل بئر لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد العد، إعادة إنفاق الخلايا في 2.5 إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من RPMI زائد B27 مع الأنسولين تكملها تركيز بوروميسين، والبذور ملليلتر واحد من الخلايا على لوحة لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في صباح اليوم التالي، استبدل الناطور ب RPMI الطازج بالإضافة إلى B27 بالإنسولين المكمل بالبوروميسين، وأعيد الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية، منعشا المتوسط مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع حتى أيام 21 إلى 28 للتصوير. لتصوير الفاصل الزمني لتقصير الساركومير في ثقافات PCCSM ، وتطبيق النفط على عدسة الهدف 100 مرة من المجهر confocal الفلورسنت ، واختيار ظروف التصوير الحي في البرامج المرتبطة بها. للحصول على بيانات تمثيلية جيدة، حدد أعلى معدل الإطار، تعيين مصراع لفتح، وتطبيق binning أربعة في أربعة في محصول من منطقة الاستحواذ لتحقيق أقصر فترات بين الصور أثناء التصوير الفاصل الزمني.
إذا كان معدل الضرب للخلايا منخفضا ، فاستحضار الخلايا عن طريق تحفيز المجال الكهربائي ، وبدء تسجيل الفاصل الزمني ، مع الحرص على أن يظل الحقل المصور في التركيز أثناء التصوير. في نهاية فترة التصوير، احفظ الصور الفاصلة الزمنية في مجلد مناسب. لتحليل الصور الفاصلة زمنيا ، افتح سلسلة من الصور الفاصلة زمنيا في ImageJ ، وضبط سطوع الصور وتباينها حتى يمكن ملاحظة نمط الساركومير بوضوح.
في القائمة أدوات أكثر، حدد SarcOptiM، واضغط على Control Shift P وزر ميكرون واحد على شريط الأدوات لاستخدام الإرشادات لمعايرة البرنامج. ثم رسم خط عبر المنطقة من ساركومير لاستخدامها لقياس تقصير ساركومير، وانقر فوق AVI خلية واحدة لبدء تحليل تقصير ساركومير. يمكن استخدام التصوير الفاصل الزمني لخلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المنقوشة والمنقوشة بالساركومير لقياس تقصير الساركومير في نقاط زمنية مختلفة.
للتغلب على عدم تنظيم الساركومير الذي لوحظ عادة في ثقافات القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المنقوشة ، يمكن استخدام طوابع PDMS محددة زراعة خلايا القلب المنقوشة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية في نمط شريطي ، مما يعزز شكل الخلية الممدود ونمط ساركومير أكثر تنظيما مقارنة بالخلايا المستزرعة في منطقة غير نمطية. كما تعزز الثقافات المنقوشة تقلصا أفضل للخلايا وتوفر ملفا جانبيا سلسا لطول الساركومير مقارنة بالخلايا المستزرعة غير النمطية. النمط المتحول AAV خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التعبير عن إشارات GFP ساركومريك على طول خلايا القلب المنقوشة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات في وقت مبكر من ثلاثة أيام بعد النقل ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس ملامح تقلصات الساركومير.
علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخدام إضافة جين مقاوم للنيستيسيدين أثناء النقل لتسهيل اختيار خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المنقوشة إلى نقاء يزيد عن 90٪ لتسهيل تحليل الصور الأسهل والأعلى جودة ، من الضروري تحديد منطقة ذات ساركومير تتحرك خطيا والحصول على صور بأعلى معدل إطار. باستخدام هذه الطريقة، يمكننا تقييم دور النضج في بروتينات الساركوما لدراسة خلل الساركومير في مختبر cardiomyocyte المستمدة من الخلايا iPS الخاصة بالأمراض والمشتقة من المريض.
