لا تزال مراحل التكوين العضوي في أجنة الفئران غير مدروسة بشكل جيد جزئيا بسبب صعوبة تصور الهياكل المعقدة للجنين. يصف هذا البروتوكول التقنيات التي تسمح بتصور وتحليل أجنة الفئران 3D و 4D أثناء التمديد المحوري والتقسيم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للباحثين بدراسة وإظهار الهياكل المعقدة لجنين الفأر ككائنات ديناميكية 3D.
يحتوي هذا البروتوكول على تقنيات يمكن استخدامها في دراسة التشوهات الخلقية التي تؤثر على الفقرة والحبل الشوكي للثدييات ، مثل الجنف. يمكن أيضا استخدام هذه التقنيات مع أنظمة النماذج في المختبر ، مما يسمح بدراسة التطور الجنيني البشري. لإعداد أجنة الفئران بين اليوم الجنيني 8.25 واليوم الجنيني 10.5 للتصوير الحي ، تشريح الأجنة في وسط M2 المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.
قم بإزالة كيس صفار البيض بلطف باستخدام ملقط نظيف واغسل الجنين مرة واحدة بوسط M2 طازج لإزالة الدم والحطام الناتج أثناء التشريح. أثناء إجراء التصوير الحي ، احتضن الأجنة في وسط DMEM منخفض الجلوكوز مع استكمال 10٪ HyClone المحدد FBS ، واثنين من الملليمولات L-glutamine ، و 1٪ البنسلين الستربتومايسين في غرفة ساخنة 37 درجة مئوية و 65٪ من الأكسجين مع بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪. لإعداد أجنة الفئران في مرحلة مماثلة للفحص المجهري المناعي ، بدلا من استخدام M2 الساخن ، تشريح الأجنة في PBS الباردة وإصلاحها في 4 ٪ paraformaldehyde.
بعد تنفيذ بروتوكول تلطيخ التألق المناعي الكامل كما هو موضح في مخطوطة النص ، يمكن تحقيق إزالة الأنسجة باستخدام RapiClear. أولا ، ضع الأجنة في وسط شريحة زجاجية مقعرة للاكتئاب 75 × 25 ملم ، وقم بإزالة كل PBST في شريحة الاكتئاب المجهري وأضف 200 ميكرولتر من محلول المقاصة ، ثم قم بتغطية إعداد الشريحة بصندوق. بعد 10 دقائق محمية من الضوء ، عندما تبدأ الأجنة في أن تصبح شفافة ، استبدل محلول المقاصة وانتظر 20 دقيقة إضافية.
أعلى الجنين مع غطاء يبدأ من جانب واحد ويتحرك بلطف نحو الجانب الآخر. العينة جاهزة الآن للتصوير. للتطهير باستخدام ميثيل ساليسيلات أو BAB ، تأكد من أن الأجنة مجففة تماما في 100٪ من الميثانول ثم ابدأ سلسلة BABB والميثانول مع زيادات متتالية بنسبة 20٪ في التركيز وحضانة لمدة 20 دقيقة لكل خطوة.
عندما يصل حل BABB إلى 100٪ ، قم بإجراء تغييرين إضافيين للحصول على حل جديد. قم بإعداد شريحة زجاجية بغطاء 20 × 60 ملم 1.5 لتركيب الأجنة لتجنب ضغط العينة. أضف فواصل مصنوعة من غسالات معدنية رقيقة.
انقل الأجنة التي تم تطهيرها إلى شرائح المجهر باستخدام مسواك أو طرف قطني ناعم أو ماصة باستور. ثم أضف قطرة من وسط التركيب ، وقم بتغطيتها بزجاج غطاء آخر مماثل وختم بالبارافين المذاب لتحقيق استقرار أفضل في التحضير لتجنب الفقاعات. ضع الغطاء على جانب واحد ثم حركه تدريجيا وبلطف جانبيا ، مع إضافة المزيد من الوسط إذا لزم الأمر.
العينة جاهزة الآن ليتم تصويرها في المجهر. استخدم فيجي/ImageJ لإعادة وضع الجنين في وضع موحد للمحور الأمامي الخلفي والظهري البطني بعد التصوير. قم بتقليل حجم مجموعة البيانات في صورة فيجي، ثم قم بقياس وإدراج قيم المقياس X و Y و Z اللازمة لتقليل مجموعة البيانات إلى أقل من 200 ميغابايت.
تأكد من تحديد خيار إنشاء نافذة جديدة. ثم انتقل إلى المكونات الإضافية وافتح 3D Viewer. داخل نافذة 3D Viewer ، انقر فوق الجنين لتحديده ، مما يتسبب في ظهور مربع 3D أحمر.
عند استخدام هذا الوضع، يمكنك التحكم في دوران مجموعة البيانات باستخدام الماوس. بعد ضمان الموضع المثالي للجنين ، حدد تحرير الصورة وتحويلها وتصدير الصورة المحولة في نافذة 3D Viewer. افحص المستويات المتعامدة المختلفة، ثم انتقل إلى الصورة، ثم قم بتكديس طرق العرض المتعامدة وتحديدها.
عندما يتم وضع الجنين بشكل صحيح ، حدد قائمة نافذة 3D Viewer ، ثم قم بتحرير مصفوفة التحويل وتحويلها وحفظها إلى ملف نصي بامتداد حصيرة. افتح الملف النصي باستخدام فيجي / ImageJ ، وقم بإزالة السطرين الأولين وإعادة حفظه. يؤدي ذلك إلى إنشاء ملف مصفوفة تحويل متوافق مع المكون الإضافي TransformJ.
قم بالتبديل إلى مجموعة بيانات الدقة الكاملة وقم بتنفيذ المكونات الإضافية للتشغيل TransformJ و TransformJ affine. في النافذة الجديدة، استعرض للبحث عن ملف المصفوفة الذي تم حفظه مسبقا، وحدد الاستيفاء المكعب B-spline وأعد تشكيله بشكل متساوي الاستواء، ثم انقر فوق موافق. بعد إعادة وضع الجنين بشكل صحيح ، قم بتقليم معظم المساحة الفارغة التي تم إنشاؤها. لتنفيذ صورة إسقاط Z كاملة ، انقر فوق المكدسات ، Z Project ، واختر أقصى كثافة.
ثم ارسم الحد الأدنى لعائد الاستثمار الذي يحتوي على الجنين بأكمله في X و Y.Switch إلى نوافذ صورة مجموعة البيانات الأصلية بالنقر فوق التحرير والتحديد واستعادة التحديد والاقتصاص عن طريق تحديد الصورة. قم بقص الشرائح في البداية والنهاية التي لا تتقاطع مع أنسجة الجنين عن طريق تحديد مكدسات الصور وفتحها ، والنقر فوق الأدوات ، وتحديد مزيل الشرائح ، وتحديد الشريحة الأولى والأخيرة المراد إزالتها ، مع التأكد من تغيير الزيادة إلى واحدة. إذا رغبت في ذلك ، قم بإجراء مزيد من التحليل وإعادة بناء 3D باستخدام التعليمات الموجودة في مخطوطة النص.
لإجراء تحليل ثلاثي الأبعاد للأجنة الأكثر تطورا ، قم بتشريح الأجنة الجنينية 18.5 جنينا في PBS الباردة ، وإزالة جميع الأغشية الجنينية الإضافية ، ثم غسل الأجنة عدة مرات في PBS جديدة لإزالة الدم والحطام الناتج أثناء إجراء التشريح. إصلاح الأجنة في 4٪ PFA المصنوعة في PBS عند أربع درجات مئوية لمدة خمسة إلى سبعة أيام. بعد غسل الجنين عدة مرات في PBS ، جفف الأجنة عن طريق احتضان 10٪ 10 زيادات متتالية من محاليل الميثانول حتى يتم الوصول إلى 100٪ من الميثانول.
قم بإجراء كل حضانة لمدة 25 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضن الأجنة بشكل منفصل على شاكر أولا لمدة يوم واحد في 5٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول ثم في 10٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول لمدة تصل إلى ثلاثة أيام حتى تفقد الأجنة كل التصبغ الطبيعي. قم بإعادة ترطيب الأجنة تدريجيا في سلسلة عكسية من الميثانول في ماء منزوع المعادن مع كل حضانة لمدة 20 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل الأجنة ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل غسل في ماء منزوع المعادن.
لتضمين الأجنة في كتل الأغاروز 1٪ ، املأ أنبوبا بلاستيكيا أو حقنة سعة 50 ملليلتر بالأغاروز المذاب ، ثم ضع الجنين في الأغاروز في وضع رأسي وحافظ على هذا الوضع بالملقط أثناء تصلب الأغاروس. ضع القالب مع الكتلة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يهتز الأغاروز بالكامل ، ثم أزل كتلة الأغاروز مع الجنين من القالب وضعها في وعاء به ماء محبط. قم بإجراء جفاف الجنين تدريجيا مع زيادة بنسبة 10٪ في تركيز الميثانول المخفف في الماء منزوع المعادن أو PBS ، مع الحفاظ على العينة في تركيز الميثانول لمدة 45 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة على شاكر حتى يتم الوصول إلى 100٪ من الميثانول.
قم بمسح الأجنة عن طريق تحريكها من خلال محلول BABB المتسلسل والميثانول لمدة 2.5 ساعة في كل تركيز مع زيادة بنسبة 25٪ في تركيز BABB حتى الوصول إلى 100٪ BABB. استبدل محلول BABB بمحلول جديد كل يوم حتى يصبح الجنين شفافا تماما. قد تستغرق هذه العملية من ثلاثة إلى خمسة أيام.
استخدم الغراء لتوصيل كتلة الأغاروز التي تم مسحها بالمحور الحركي للماسح الضوئي OPT ، ثم اضبط البصريات للحصول على صورة للجنين بأكمله والمضي قدما في الحصول على مجموعة بيانات إسقاط كاملة. تتيح تقنية التصوير الحي 4D التحليل الديناميكي لتعبير مراسل LuVeLu والأجنة الجنينية 8.5 Snai1 المشروطة. جنبا إلى جنب مع إشارة LuVeLu الطبيعية على الأديم المتوسط presomitic ، تعرض الأجنة الضربة القاضية المشروطة Snai1 تعبير LuVeLu في الانتفاخ خارج الرحم الذي ينشأ من الخط البدائي.
تسمح اختبارات التألق المناعي الكامل بالكشف عن NMPs المحتملة والمنظمين الرئيسيين لتمايز الأديم المتوسط. تسلط الأسهم البيضاء والصفراء الضوء على الاختلافات في الأجنة المتحولة والبرية. 3D تقديم كامل جبل المناعية تمكن من فهم أفضل للأنسجة أو الهيكل في الدراسة.
في هذه الحالة ، تم التحقيق في موقع NMPs المحتملة في برعم الذيل. إعادة بناء الأنسجة 3D مهمة أيضا لفهم وتوصيف العيوب المورفولوجية في أجنة الفئران. يمكن أيضا بناء التصور التفاعلي لإعادة الإعمار 3D بتنسيقات سهلة الاستخدام.
على سبيل المثال، في ملف PDF. يمكن استخدام هذه الهياكل الذيلية الجنينية ثلاثية الأبعاد لتوضيح قوة النماذج ثلاثية الأبعاد لجمهور أكثر عمومية وللمساعدة في الدراسة في تعليم الاستطالة المحورية الفقارية وتقسيمها. أخيرا ، من الممكن استخدام 3D في تصور toto لأجنة الفئران الأكثر تطورا باستخدام تقنية الفحص المجهري OTP.
يتم عرض عروض متحركة هنا ، مع تسليط الضوء على شرائح رئيسية من أجنة اليوم الجنيني 18.5. أهم شيء يجب تذكره هو أن النتيجة يجب أن تظل تمثيلا أمينا لما لوحظ في الجنين. يمكن للباحثين استخدام هذه الأساليب لتجاوز تقديم الصور الثابتة فقط ، ولكن أيضا تضمين مقاطع الفيديو وإعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد وحتى نماذج 3D التفاعلية لبياناتهم.
