ميكوسيليال ظهارة خطوط الأعضاء الداخلية لجسمنا ويوفر خط الدفاع الأول عن طريق مسح الجسيمات الأجنبية. هذا البروتوكول يجعل من الممكن لتوليد الخلايا الجنينية مشتقة الظهارية الظهارية في 24 ساعة. الميزة الرئيسية لطريقتنا هي أنه يمكننا مراقبة التقدم الحي لانتقالات الخلايا على سطح الأعضاء.
هذا البروتوكول القابل للاستنساخ والقابلة للتطوير والسريع للعضية النامية سيسمح للباحثين بمعالجة الأسئلة الأساسية لبيولوجيا الظهارة المخاطية. للبدء ، والحصول على أجنة X.Laevis عن طريق جمع البيض يدويا من الضفادع الأنثوية المحفزة وأداء الإخصاب في المختبر. دي هلام الأجنة المخصبة مع التحريض لطيف في 2٪ السيستين، في ثلث X-تعديل ملح بارث لمدة خمس دقائق تقريبا.
زراعة الأجنة في XMBS ثلث في درجة الحرارة المفضلة حتى يتم الكشف عن العلامات الأولى للمرحلة 10، مثل ظهور الخلايا المصطبغة الداكنة حول الفيتامور في المنظر النباتي. اختر واجمع الأجنة عند وصولها إلى المرحلة المبكرة 10 باستخدام أدوات الشعر تحت منظار مجسم. نقل الأجنة المختارة إلى طبق بيتري مملوء DFA مع ماصة نقل يمكن التخلص منها.
ثم قم بإزالة غشاء الفيتيلين للأجنة باستخدام ملقط حادة من الجانب النباتي ، دون تعطيل الجانب الحيواني للجنين. لعزل الغطاء الحيواني، ضع الجانب الحيواني للجنين. تقدير بصريا مدى غطاء الحيوان ليتم استئصالها وجعل الشق الأول على طول الحافة بسكين الشعر، وسحب السكين إلى الخارج لجعل قطع.
كرر هذه العملية لإنشاء سلسلة من التخفيضات الصغيرة لمعالجة الغطاء الحيواني. تقليم حافة سميكة الطبقات من غطاء الحيوان باستخدام سكين الشعر لمنع إدراج السلائف mesoderm. لفصل الخلايا الاكستودرومية العميقة عن غطاء الحيوان، نقل قبعات الحيوانات المفككة إلى طبق بيتري مليء بالكالسيوم وDFA الخالية من المغنيسيوم مع ماصة نقل يمكن التخلص منها.
ضع قبعات الحيوانات لمواجهة الجانب الحيواني ، مع الحفاظ على مسافة سخية من explants الأخرى. انتظر لمدة خمس إلى عشر دقائق، ثم قم بمراقبة explants تحت منظار مجسم. بمجرد أن يتم تحرير الخلايا العميقة المخفّفة من حافة الطبقة السطحية الداكنة المصطبغة ، ابدأ في رفع الطبقة السطحية بعيدًا عن خلايا البشرة العميقة ذات الألوان الفاتحة.
فصل بعناية طبقة سطحية بسكين الشعر، بدءا من الحافة. ثم جمع الخلايا العميقة الأكتودر مع القليل من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من DFA قدر الإمكان. نقل الخلايا المجهرية العميقة التي تم جمعها إلى أنابيب PCR غير لاصقة تحتوي على 200 ميكرولتر من DFA والماصات بلطف وسائل الإعلام مرتين إلى ثلاث مرات لتفريق الخلايا المنقولة.
أغلق الأنابيب واحفظها منتصبة للحث على التجميع التلقائي في الأسفل. راقب عملية التجميع تحت مجهر ستيريو. تتجمع الخلايا عادة في الجزء السفلي من أنبوب PCR في غضون ساعة وتتجمع في مجاميع كروية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات اعتمادا على الحجم.
لإجراء التصوير الحي أو اختبار المخدرات أثناء تطوير الأعضاء الظهارية المخاطية ، قم بجمع المجاميع في ساعتين بعد التجميع باستخدام ماصة 200 ميكرولتر مزودة بنصائح مكبرة. للسماح للمجاميع لتطوير إلى organoids الظهارية المخاطية في الثقافة، وجمعها من أنبوب PCR في خمس ساعات بعد التجميع ونقلها إلى طبق بيتري مملوءة DFA. ضع المجاميع بعيدا عن بعضها البعض لمنع الذوبان.
في غضون 24 ساعة من الثقافة في درجة حرارة الغرفة ، دون أي عوامل إضافية ، يمكن ملاحظة الأعضاء الظهارية المخاطية الناضجة بالتناوب بسبب الأهداب الضرب التي تغطي سطح الظهارة المتمايزة. إعداد غرفة التصوير الزجاجي القاع عن طريق الإلتصاق بغلاف زجاجي لتغطية غرفة الاكريليك المطحونة المخصصة مع الشحوم السيليكون، وختم الغرفة بإحكام لمنع تسرب وسائل الإعلام الثقافة، ثم ملء غرفة التصوير مع DFA. التقط واحدة من المجهر الإلكترون الإرسال السداسي أو شبكة TEM باستخدام ملقط وتطبيق كمية صغيرة من الشحوم على حافة الشبكة.
اضغط لأسفل برفق لتأمين شبكة TEM إلى أسفل غرفة التصوير. نقل المجاميع إلى غرفة التصوير ووضعها داخل الشبكة. ملء الغرفة مع DFA وختم عليه مع غطاء الزجاج والشحوم.
لمتابعة تطور تشكيل الظهارية المخاطية، وجمع الوقت المنقضي Z-كومة الصور من المجاميع باستخدام المجهر confocal. تم إنشاء ضوئيات ظهارية مُمَثَلة من ذريات متعددة القدرات من أجنة X.Laevis في مرحلة gastrula المبكرة. تحتوي العضيات على بشرة ناضجة لا يمكن تمييزها عن الزبرجد بما في ذلك ظهارة متمايزة تمامًا وخلايا goblet مخاطية وخلايا متعددة الاستنسل وخلايا إفرازية صغيرة.
تليها ديناميات التنمية العضوية من خلال التصوير الحي. لفحص الظهارة التي تظهر في مرحلة مبكرة من التكوين العضوي ، تم تسمية الأجنة ببروتينات تقاطع ضيقة الموسومة بالفلورسنت والبروتينات المترجمة للغشاء. مع وضع العلامات المزدوجة يمكن تمييز الخطوات التسلسلية من ZO-1 تشكيل تقاطع ضيق إيجابي وتحليلها كميا أثناء الظهارة.
وقد تشتتت بعض المناطق من التصاق الخلية الخلية puncta من ZO-1 في مراحل مختلفة من الظهارة. في المقابل، مناطق أخرى قد تجميعها بالكامل التعبير زو-1 متجاورة. مع مرور الوقت البونكتا و الاندماج والاتصال لتشكيل تقاطعات ضيقة متجاورة، والتي تحافظ على مورفولوجيا حتى أثناء انقسام الخلية.
كما تنضج تقاطعات ضيقة، والخلايا تتحرك بشكل حيوي داخل وخارج السطح على طول الطائرات apical من organoids. التحليل متعدد المقاييس ممكن عن طريق تتبع الخلايا spatio-زمنيا على سطح organoids التفريق. عند محاولة هذا البروتوكول، تذكر أن تضع الجانب المصطبغ الداكن لغطاء الحيوان المعزول الذي يواجه لأعلى ويرصده تحت منظار مجسم.
من المهم فصل الطبقة السطحية من غطاء الحيوان في التوقيت المناسب في وسائل الإعلام DFA خالية من الكالسيوم / المغنيسيوم. يقدم هذا البروتوكول البسيط طرقًا مفيدة لدراسة سلوكيات الخلايا الديناميكية بالإضافة إلى الآليات الجزيئية والفيزيائية التي تنظم ظهارة المخاطية.
