ثقافة الخلايا العصبية المشتقة من المنافذ العصبية في الكبار فولز

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التحقيق في الاختلافات المعتمدة على الجنس في المنافذ العصبية ، وفهم المرونة العصبية ، والتغيرات التي تؤكد التفاعلات الاجتماعية في المرج. إن فحص الخلايا العصبية هو أداة ممتازة لتحديد انتشار وتمايز الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف. للبدء، ضع طبق بيتري على سطح محاط بالثلج.

إيداع الدماغ على الطبق وإضافة 20 ملليلتر من محلول غسل الباردة. في الطائرة التاجية، تقسيم الدماغ إلى كتلتين من الأنسجة باستخدام مشرط، وأداء القطع على مستوى بريما في المحور الأمامي الأمامي. استخراج المنطقة دون البطينية، أو VZ، الأنسجة من كتلة روسترالية، والجيروزات، أو DG، الأنسجة من كتلة السد.

لتشريح VZ ، عقد واحدة من نصفي الكرة الأرضية مع ملقط دومون ، وإدراج نصائح غرامة من ملقط الثاني تحت الأنسجة التي خطوط caudate- putamen. افتح الملاطس على طول المحور الظهري البطني لفصل الأنسجة، وجمع VZ في أنبوب الطرد المركزي مع مليلترين من محلول الغسيل البارد. لا تجمع نسيج أكثر من حيوانين.

كرر microdissection في نصف الكرة الأرضية الآخر وتخزين أنبوب مع الأنسجة على الجليد. لتشريح DG، استخدم مشرط لجعل قطع إكليلية في كتلة السد، للحصول على شريحتين التي لوحظ تشكيل فرس النهر. استخدام ملقط دومون لعقد واحدة من شرائح، وجعل قطع أفقي بين DG وCA1 مع ملقط آخر.

ثم، إجراء شق عمودي بين DG وCA3، لفصل DG. كرر التشريح في نصف الكرة الأرضية الآخر من الشريحة الأولى، ثم في نصفي الكرة الأرضية في الشريحة الثانية. جمع أربع قطع DG من كل فول في أنبوب الطرد المركزي. ضع أنابيب الطرد المركزي داخل خزانة السلامة البيولوجية وانتظر حوالي 10 دقائق حتى تترسب شظايا الأنسجة بالجاذبية.

ثم، إزالة محلول الغسيل وإضافة ملليلتر واحد من محلول الأنزيمات الدافئ لكل أنبوب. احتضان الأنابيب في 37 درجة لمدة 10 دقائق. لتفكك شظايا الأنسجة، ماصة لهم صعودا وهبوطا مع طرف ملليلتر واحد، ولكن لا الماصات أكثر من 30 مرة.

كرر الحضانة في 37 درجة مئوية، ثم ماصة الأنسجة مرة أخرى. إضافة تسعة ملليلتر من N-2 المتوسطة لكل أنبوب لتخفيف العلاج الأنزيمي، والطرد المركزي الأنابيب في 200 مرة ز لمدة أربع دقائق. تخلص من المُندفع، واغسل الخلايا بـ 10 ملليلترات من N-2 المتوسطة، وكرر الطرد المركزي.

إزالة ناظر من كل أنبوب، وإعادة تعليق الكريات الخلية من VZ وDG في مليلتر وميليلتر واحد من متوسطة B-27، على التوالي. قم بتميّز كل تعليق خلية بمزاج 40 ميكرومتر لإزالة أي نسيج غير مهضم. ثقافة الخلايا المصفاة في مرفق منخفضة للغاية 24-جيدا لوحة، وذلك باستخدام اثنين من الآبار لVZ وبيرامل واحدة لDG. إضافة 20 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل النمو الليفي 2، و 20 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل النمو البشرة لكل بئر، ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والرطوبة العالية لمدة 48 ساعة.

بعد الحضانة، وإزالة نصف المتوسطة الثقافة واستبدالها ببي 27 المتوسطة الطازجة، تستكمل مع تركيزات مزدوجة من عوامل النمو. كرر هذه العملية كل يوم ثالث. في الأيام التي لا يكون فيها من الضروري تغيير الوسط الثقافي، أضف عوامل النمو إلى التركيز النهائي لـ 1X.

تشكلت الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية العصبية المعزولة من المنطقة دون البطينية و gyrus دنتات من كل من الإناث والذكور الكبار البراري voles. وعلى الرغم من وجود حطام في الثقافة الأولية، لم تكن توجد سوى الـ"neurophes" بعد مرورها الأول. وقد تم الحصول على عدد أكبر من الخلايا العصبية من المنطقة دون البطينية للأنثى مقارنة بالمنطقة دون البطينية للذكور، أو الجيروسكوبات الزفيرة للإناث والذكور على حد سواء، مما يشير إلى أن عدد الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها يعتمد على المنطقة التكاثرية والجنس.

قُسّر قطر الـ neurospheres في أيام 8 و11 و14. هو زاد تدريجيّا ل [فجر] ذكرا وأنثى في كلا مناطق عصبيّة, غير أنّ [نيووسفيرس] يستنتج من الذكر أدمغة كان صغيرة [إين فّو] إلى أنّ [إين فّي ا] من الدماغ أنثويّة. تم تمييز الـ neurosphers في اليوم السادس في وجود عوامل النمو، أو في اليوم 15 دون عوامل نمو.

في اليوم السادس، في ظل ظروف غير متمايزة، عبرت الخلايا المشتقة من الغلاف العصبي عن نستين، وهي علامة للنسل العصبي. وكان من الممكن أيضا تحديد الخلايا الإيجابية المزدوجة الكورتين وعلامة الانتشار كي-67، التي تشير إلى وجود إما سلائف الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية غير ناضجة. ومع ذلك، فإن عدم حوسبة كي-67 مع DCX يشير إلى وجود الأروميستات العصبية بعد اللتفت.

في اليوم 15، في ظل ظروف التمايز، تم العثور على الخلايا العصبية الناضجة والخلايا ذات النمط الظاهري الدالي، مما يدل على إمكانات التمايز للخلايا المعزولة. عند محاولة هذا البروتوكول، نضع في اعتبارنا أن القدرة على التعرف وبعد الممارسة السابقة في microdissection أمر أساسي لعزل الخلايا فقط من المنافذ العصبية. بعد هذا البروتوكول، يمكن تصميم التجارب لتحديد الآليات المشاركة في انتشار وتمايز وبقاء الخلايا الجذعية والنسل العصبية، وهي عمليات لا تزال غير معروفة في المرج.