مرحبًا بكم. إذن هذا بروتوكول شمالي صغير للـ(رنا) انها مشتقة بروتوكول الأمثل أصلا من قبل الدكتور رشيد Akbergenov.
في هذه الطريقة، يمكن للمرء أن يكتشف RNA الصغيرة في أي مكان بين 20-24 النيوكليوتيد في الطول، بدقة شديدة وبدقة عالية جدا. البروتوكول هو في الأساس شكل معدل من التحليل الشمالي التقليدي ، ولكن هنا ، فإن نسبة الأكريلاميد مرتفعة جدًا ، فهي 15 في المائة. هذا شماليّ يستطيع كنت استعملت ل يكشف سابقا يعرف [رنا] صغيرة, إمّا ميكرو رنا أو أخرى مجموعة من [رنا] صغيرة, عندما التسلسل يكون عرفت أو هو يستطيع كنت استعملت ل تأكيد من وفرة من [رنا] صغيرة يأتي من جيل تالية تسلسل مجموعة بيانات.
ميزة من هذه الطريقة هو أن, لا يمكن للمرء أن ننظر فقط في وفرة RNA الصغرى, ولكن أيضا وفرة من السلائف, على سبيل المثال قد يترك RNAs الصغيرة خارج السلائف التي هي حوالي 30 إلى قد يكون بضع مئات من النيوكليوتيدات طويلة, وهذا يمكن أيضا الكشف عنها في وقت واحد, جنبا إلى جنب مع الحمض النووي الريبي الصغير. البروتوكول بسيط جدا، على التوالي جدا إلى الأمام، ولكن يجب على المرء أن يكون حذرا جدا في حين إجراء بعض الخطوات الحاسمة التي ترد في نهاية هذا البروتوكول. لإعداد مزيج هلام 10 مل، إضافة 4.8 غرام من اليوريا، 3.75 مل من 40٪ محلول أكريلاميد، و 1 مل من 10X TBE الطازجة المعدة، pH 8.2 وخلط بلطف الحل.
يُذوّب اليوريا تمامًا، عن طريق تسخين الخليط في حمام مائي، حتى يبدو المحلّل واضحًا. تشكل وحدة التخزين إلى 10 مل، وذلك باستخدام الماء معقمة MilliQ وتبريد مزيج هلام إلى درجة حرارة الغرفة. غسل الجهاز المطلوب مع المنظفات، فرك لهم بلطف لإزالة المتبقية TBE والأكريلاميد.
مزيد من شطف لهم مع المياه MilliQ والسماح لها لتجف. تجميع لوحة زجاجية معا، وضمان كل منهما في نفس المستوى. وضعها بحزم على الاسفنج.
إضافة 8 ميكرو لتر من TEMED و 80 لتر صغير من 10٪ APS أعدت طازجة لمزيج هلام. مزيج بلطف وصب مزيج هلام لوحات تجميعها. تأكد من أن الجل لا تسرب.
ضع المشط بعناية. السماح للجل البلمرة لمدة 45 دقيقة تقريبا. بعد البلمرة من هلام، وإزالة لوحات الزجاج من الجمعية.
اغسل الألواح الزجاجية بالماء ميليك. ووضعها في الكاسيت الجاري. ضع الكاسيت الجاري داخل الخزان.
صب أعدت حديثا 1X TBE، pH 8.2. إزالة المشط بعناية. غسل آبار هلام جيدا عن طريق الأنابيب العازلة.
هذه الخطوة يزيل الترسبات من اليوريا من البئر ويخفف RNA لتشغيل موحد عبر هلام. أغلق غطاء الجهاز وركض ما قبل الجل الفارغ عند 80 فولت لمدة 30 دقيقة ، للتحقق من وجود أي تسرب عازل. لإعداد 10 مل صبغة التحميل، تزن 5 ملغ من بروموفينول الأزرق، 5 ملغ من السيلين سيانول وإضافة 10 مل من فورماماميد deioinised وخلطها جيدا.
Aliquot الصبغة وتخزينها في 4 درجة لمزيد من الاستخدام. Aliquot 10 ميكروغرام من مجموع RNA في أنابيب معقم 1.5 مل. تأكد من أن نوعية الجيش الملكي النيبالي، أي.
نسبة 260:230 أكبر من أو أقرب إلى اثنين. وضع أنبوب داخل speedVac وفراغ الجافة العينات. إعادة تعليق عينات الحمض النووي الريبي المجفف في 8 ميكرو لتر من صبغة التحميل.
سخني العينات على درجة حرارة 98 لمدة دقيقتين. تبريدها لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. دوامة عينات الحمض النووي الريبي المبردة لضمان إعادة تعليق السليم في صبغة التحميل.
تدور الأنابيب. كرر خطوات التدفئة والتبريد ودوامة لمدة ثلاث مرات للحصول على RNA المتدفقة بحرية. أوقف الركض المسبق للجل.
اغسل الآبار جيداً، قبل تحميل العينة، لإزالة رواسب اليوريا داخل الآبار. سخني عينات الحمض النووي الريبي التي أعيد تعليقها عند 98 درجة لدقيقة واحدة. تحميل العينات الساخنة في الآبار باستخدام نصائح شعرية.
تجنب إدخال فقاعات الهواء. تحميل كامل لجميع العينات وتجميع الغطاء. تشغيل الجل في 80 فولت لمدة ثلاث ساعات أو حتى يعمل الأزرق بروموفينول تماما.
استخدام غشاء النايلون المشحونة إيجابيا لنقل. قطعه لأبعاد لوحة زجاجية. تسمية الغشاء في الزاوية اليمنى العليا.
ضع الغشاء بلطف على سطح المياه المعقمة MilliQ تأكد من وضع الجانب الملصق إلى الأسفل ، في مواجهة سطح الماء. خذ صينية نظيفة واحضر ساندويتش هلام لنقلها كهربائيا. ضع الجانب الرمادي من الكاسيت لأسفل.
صب 1X TBE قليلا فوق مستوى كاسيت. قبل الرطب لوحة الألياف في 1X TBE والضغط عليه لإزالة فقاعات الهواء. قطع قطعتين من الورق النشاف إلى حجم وسادة الألياف.
قبل الرطب قطعة من الورق النشاف في 1X TBE ووضعها على وسادة الألياف. إزالة فقاعات الهواء عن طريق المتداول ماصة بلاستيكية على الورق. قبل الرطب قطعة أخرى من الورق النشاف في 1X TBE ووضعها على الكاسيت.
لفة أكثر لإزالة فقاعات الهواء. الآن إعداد ساندويتش جاهز للنقل الكهربائي. بعد الانتهاء من electrophoresis، ووقف تشغيل وإزالة الغطاء من الجهاز.
قم بإزالة الكاسيت قيد التشغيل من الإعداد. أخرج اللوحات الزجاجية من الكاسيت الجاري. إزالة بعناية هلام من الجمعية.
وضعها على ورقة النشاف بحيث أول عينة الحمض النووي الريبي تحميل نحو حقك. تراجع بلطف الغشاء قبل نقع في 1X TBE ووضعها على هلام، التي تواجه الجانب المسمى إلى أسفل. لا تسمح للغشاء والجل لتجف.
لفة فوق بلطف لإزالة فقاعة الهواء. تراجع قطعة واحدة من الورق النشاف في 1X TBE ووضعها على الغشاء. إزالة فقاعات الهواء.
وضع قطعة أخرى من الورق النشاف وإزالة فقاعات الهواء. إكمال شطيرة عن طريق وضع وسادة الألياف على الجمعية. أغلق الكاسيت بإحكام.
ضع الكاسيت عبر لطخة في الوحدة النمطية. ملء خزان مع 1X TBE، pH 8.2، تصل إلى علامة النشاف. أغلق غطاء الجهاز ونقله عند 10 فولت بين عشية وضحاها عند 4 درجات أو في غرفة باردة.
حافظ على وصلة الأشعة فوق البنفسجية عبر جاهزة وتعيينه إلى 1200، قبل الانتهاء من نقل الكهربائية. بعد الانتهاء من نقل، وإزالة كاسيت من وحدة. ضع الغشاء الرطب على ورقة A4، ووضع الجانب المميز لأعلى.
عبر ربط الجيش الملكي النيبالي إلى الغشاء عن طريق التشعيع مع 254 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية في 120 مللي جول. ويمكن تخزين البقعة المترابطة عند أربع درجات أو استخدامها في التهجين. تصميم مسبار مجاني تماما لرنا الصغيرة التي يجب الكشف عنها.
نهاية التسمية المسبار في انها خمسة نهاية رئيس باستخدام انزيم PNK والجمع بين المكونات كما هو مبين. احتضان خليط التفاعل في 37 درجة لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة من الحضانة استخدام G-25 أعمدة لفصل المسابير unlabeled من خليط التفاعل.
لتحسين وضع العلامات للمسبار، قم بإعداد عمود G-25 قبل الاستخدام. وضع لطخة، الجانب RNA التي تواجه أعلى، داخل زجاجة التهجين. مزيج بقوة المخزن المؤقت التهجين قبل الاستخدام.
إضافة 10 مل من العازلة التهجين داخل ووضع زجاجة التهجين داخل الفرن التهجين، والحفاظ على 35 درجة مع دوران. تنفيذ ما قبل التهجين لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد ما قبل التهجين إزالة زجاجة من الفرن.
إضافة التحقيق المسمى إلى المخزن المؤقت التهجين بلطف. تأكد من عدم خلق فقاعات الهواء. احتضان لطخة داخل الفرن في 35 درجة مع دوران لمدة 12 ساعة.
بعد التهجين، قم بإزالة المخزن المؤقت التهجين من الزجاجة. قم بإجراء غسل سريع لللطخات، باستخدام مخزن الغسيل العازل I. يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة حل التهجين الزائد من البقع.
مزيد من احتضان البقع في 35 درجة لمدة 30 دقيقة باستخدام غسل العازلة I. قم بإجراء غسيل آخر باستخدام المخزن المؤقت-II في 35 درجة لمدة 30 دقيقة. بعد غسل البقعة، ضعها داخل غطاء التهجين، وإزالة العازلة الزائدة وختمه.
وضعه داخل كاسيت ويعرضه على شاشة خالية من الإشعاع فوسفو- صور لمدة 12 ساعة. اكتشاف إشارة التهجين باستخدام صور الاعصار الجزيئي الحيوي وتحليل النتائج باستخدام برنامج ImageJ. لتهجين من البقعة مع تحقيقات أخرى، تنفيذ خطوات تجريد كما هو موضح.
مع هذا تقنية واحدة يستطيع تقدير الوفرة من [رنا] دقيقة, [س] هو طول. من هذه الصورة، يمكن الكشف عن التعبير عن RNA 397 الصغرى في جميع العينات. في هذه البقعة ، وفرة عينة واحدة هو ما يقرب من 5 يقرأ في المليون ، وفقا لبيانات تسلسل الجيل القادم ، مما يشير إلى أن أسلوبنا يمكن الكشف عن أقل وفرة RNAs الصغيرة أيضا.
بالإضافة إلى ذلك، باستخدام برنامج قياس الكم ImageJ، يمكن للمرء أن يحدد كمي التعبير عن 397 الدقيقة بين العينات. هنا استخدمنا U6 وMIcro RNA 168 كضوابط التحميل. وسوف أتحدث عن بعض الخطوات الحاسمة التي يجب النظر فيها أثناء تنفيذ التجربة.
تأكد من استخدام RNA ذات نوعية جيدة لإعداد العينة. بينما فراغ تجفيف العينات، وتجنب أكثر من تجفيفها. إعادة تعليق الجيش الملكي النيبالي في صبغة التحميل أمر بالغ الأهمية.
ضمان إعداد عينة التدفق الحر. يجب توخي الحذر أثناء تحميل الجل. يجب غسل آبار الجل ويجب تحميل العينة في خط مستقيم داخل الآبار.
أثناء النقل الكهربائي، وانتشار الغشاء في الماء، قبل غمسه في 1X TBE أمر ضروري، فإنه يحسن النقل. التهجين من البقعة ينبغي كنت أنجزت في 35 درجات. الحفاظ على درجة حرارة الفرن التهجين.
للاستخدام المتكرر لللطخات، يجب تخزين الأغشية عند 4 درجة. وينبغي أن تبقى رطبة في 2X SSE. وعلى عكس الطرق الأخرى القائمة على أساس PCR، فإن هذه الطريقة تضمن التحديد الكمي للتعبير، وكذلك تحديد حجم الرنا الرنا الصغير.
