أليساندرا دازو حاصلة على كرسي مجوهرات الأطفال (JFC) في علم الوراثة والعلاج الجيني. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01GM104981 و RO1DK095169 و CA021764 ومؤسسة أسيزي في ممفيس والجمعيات الخيرية الأمريكية اللبنانية السورية.

تم تنفيذ جميع الإجراءات في الفئران وفقا لبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال وإرشادات المعاهد الوطنية للصحة.
1. إعداد الحلول والوسائط
<ol><li>تحضير محلول الهضم عن طريق خلط 15.4 مل من PBS مع 2.5 مل من 20 مجم / مل كولاجيناز P (5 مجم / مل تركيز نهائي) ، 2 مل من 11 وحدة / مل ديسباز II (1.2 وحدة / مل تركيز نهائي) ، و 100 ميكرولتر من 1.0 M CaCl2 (تركيز نهائي 5 mM).</li>
	<li>تحضير 500 مل من وسط الخلايا الليفية الأولية (DMEM كاملة) عن طريق خلط 440 مل من DMEM مع 50 مل من FBS (10٪) ، 5.0 مل من القلم / البكتيريا (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل ، على التوالي) و 5.0 مل من مكمل الجلوتامين (2 مللي مول). قم بتصفية وتعقيم الوسط باستخدام مرشح فراغ بحجم المسام 0.22 ميكرومتر.</li>
	<li>قم بإعداد مصل خال من الإكسوسوم عن طريق الطرد المركزي الفائق ل FBS طوال الليل في أنابيب البولي بروبلين سعة 38.5 مل عند 100000 × جم عند 4 درجات مئوية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.</li>
	<li>تحضير 500 مل من الوسط الخالي من الإكسوسوم عن طريق خلط 440 مل من DMEM مع 50 مل من المصل الخالي من الإكسوسوم (10٪) ، 5 مل من القلم / البكتيريا (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل) ، و 5 مل من مكمل الجلوتامين (2 ملليمول). قم بتصفية وتعقيم الوسط باستخدام مرشح فراغ بحجم المسام 0.22 ميكرومتر.</li>
	<li>تحضير 0.5 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) عن طريق إذابة 6.057 g من قاعدة Tris في 90 mL من dH 2 O وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك. اضبط مستوى الصوت على 100 مل باستخدام dH2O.</li>
	<li>تحضير محلول 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) / 1 mM Mg (Ac) 2 (محلول عمل السكروز) عن طريق خلط 97.9 مل من dH 2 O مع 2 مل من 0.5 M Tris-HCl (درجة الحموضة = 7.4) و 100 ميكرولتر من 1 M Mg (Ac)2. أضف مثبطات الأنزيم البروتيني إلى المحلول قبل الاستخدام مباشرة واحتفظ بالمحلول على الجليد.</li>
	<li>تحضير محاليل تدرج كثافة السكروز على الجليد وفقا للجدول 1. هذه المحاليل كافية لإعداد أنبوبين متدرجين للسكروز.</li>
	<li>تحضير 100٪ TCA عن طريق إضافة 40 مل من dH2O إلى 100 غرام من مسحوق TCA وتخلط حتى يذوب تماما. اضبط مستوى الصوت النهائي باستخدام dH2O إلى 100 mL.</li>
	<li>تحضير 80٪ إيثانول عن طريق خلط 20 مل من dH2O مع 80 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.</li>
	<li>قم بإعداد المخزن المؤقت لتشغيل اللطخة الغربية عن طريق خلط 1.8 لتر من dH2O مع 200 مل من المخزن المؤقت للتشغيل 10x.</li>
	<li>قم بإعداد المخزن المؤقت لنقل اللطخة الغربية عن طريق خلط 1.4 لتر من dH2O مع 200 مل من محلول نقل 10x و 400 مل من الميثانول. قم بتبريد المخزن المؤقت للنقل إلى 4 درجات مئوية.</li>
	<li>تحضير 20x محلول ملحي مخزن تريس (TBS) عن طريق إذابة 122 جم من قاعدة تريس و 180 جم من كلوريد الصوديوم في 850 مل من dH2O (درجة الحموضة 8.0). اضبط مستوى الصوت على 1 لتر باستخدام dH2O.</li>
	<li>تحضير المخزن المؤقت المانع عن طريق إذابة 5 جم من الحليب الجاف الخالي من الدسم مع 1 مل من 10٪ توين -20 ، 5 مل من 20x TBS ، و 94 مل من dH2O.</li>
	<li>تحضير المخزن المؤقت للأجسام المضادة عن طريق إذابة 3 جم من BSA مع 1 مل من 10٪ Tween-20 ، و 5 مل من 20x TBS ، و 94 مل من dH2O.</li>
	<li>تحضير المخزن المؤقت للغسيل عن طريق خلط 100 مل من 20x TBS و 20 مل من 10٪ Tween-20 (10x) مع 1.88 لتر من dH2O.</li>
	<li>تحضير محلول تطوير عن طريق خلط 1 حجم من اللومينول / تعزيز مع حجم واحد من العازلة بيروكسيد مستقرة.</li>
</ol>2. تشريح عضلة الفأر الساقي (GA)15,16
<ol><li>تحضير أنابيب 50 مل تحتوي على 10 مل PBS على الجليد.</li>
	<li>القتل الرحيم للفئران في غرفة CO2 تليها خلع عنق الرحم.</li>
	<li>إزالة عضلة gastrocnemius من كلا الساقين ونقلها إلى الأنبوب مع برنامج تلفزيوني على الجليد. ملاحظة: قم بإزالة العضلة الوحيدة من عضلة GA قبل نقل عضلة GA إلى PBS.</li>
</ol>3. عزل الخلايا الليفية الأولية للفأر والثقافة
<ol><li>وزن العضلات ونقلها إلى طبق 10 سم تحت غطاء السلامة الحيوية. فرم العضلات بالمشارط حتى تصبح عجينة ناعمة.</li>
	<li>انقل معجون العضلات المفروم ناعما إلى أنبوب سعة 50 مل وأضف 3.5x حجم / مجم من محلول الهضم إلى الأنبوب واحتضانه لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. امزج التعليق جيدا باستخدام ماصة سعة 5 مل كل 10 دقائق (سيساعد ذلك في التفكك التام). ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مفكك الأنسجة لهذه الخطوة.</li>
	<li>أضف 20 مل من DMEM كاملة إلى تعليق الخلية لتعطيل محلول الهضم. نقل إلى مصفاة خلية نايلون 70 ميكرومتر وضعت على أنبوب 50 مل. اجمع التدفق واغسل مصفاة الخلية ب 5 مل إضافية من DMEM كاملة.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق وإزالة المادة الطافية بعناية.</li>
	<li>أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من DMEM كاملة وزرع الخلايا في طبق 10 سم.</li>
	<li>استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2 (المقطع 0 أو P0). ملاحظة: 1) يجب الحفاظ على هذه الثقافات عند مستوى أكسجين منخفض لضمان ظروف شبيهة بالفسيولوجية (مستوى O 2 في العضلات الهيكلية حوالي2.5٪) 17. 2) رقم المرور (على سبيل المثال ، P0) لمزرعة الخلية هو سجل لعدد المرات التي تم فيها زراعة المزرعة الفرعية. 3) يتم استزراع الخلايا الليفية الأولية في P0 بشكل روتيني حتى التقاء 100٪ بالإضافة إلى يوم واحد (وفقط ل P0). هذا لتطهير أنواع أخرى من الخلايا والتأكد من أن الخلايا الموجودة في المزرعة ليست سوى خلايا ليفية ، مستنفدة من الخلايا العضلية على أساس الفحص المجهري. تحتوي العضلات الهيكلية من بالغ في عمر شهرين على حوالي 2٪ من الأسلاف العضلية4. بالإضافة إلى ذلك ، لا تعلق الأسلاف العضلية عادة على الأطباق غير المطلية ؛ لذلك ، يتم فقدها أثناء الاستزراعالفرعي 18،19،20. تتطلب الخلايا العضلية وسيطا مختلفا (F10) مكملا ب 20٪ FBS وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) 18. في DMEM الكامل ، يكون للخلايا الليفية المتوسطة معدل تكاثر أعلى من الخلايا العضلية ، مما يؤدي إلى القضاء على هذه الخلايا الملوثة قبل الممر الأول.</li>
	<li>شطف خلايا P0 مع برنامج تلفزيوني عندما 100٪ متقاربة بالإضافة إلى 1 يوم. أضف 1 مل من محلول التربسين واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2 لفصل الخلايا. إيقاف النشاط الأنزيمي باستخدام 10 مل من DMEM كاملة.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 10 دقائق في RT وإعادة تعليق بيليه في 20 مل من DMEM كاملة والبذور في طبق 15 سم (الممر 1 أو P1). تنمو الخلايا حتى التقاء 80٪ -90٪ ويمكن توسيعها حتى المرور 3. ملاحظة: اعتمادا على تجارب المصب ، يمكن استخدام المقطع 1 أو المقطع 2 (P2) أو المقطع 3 (P3).</li>
</ol>4. بذر الخلايا وجمع الوسط المشروط
<ol><li>اغسل الخلايا الليفية (P1 أو P2 أو P3) ب 10 مل من PBS ، وأضف 2.5 مل من محلول التربسين إلى الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2. إيقاف النشاط الأنزيمي باستخدام 10 مل من DMEM كاملة. ملاحظة: بعد المرور 4 ، يتم التخلص من الخلايا الأولية ويجب عدم استخدامها لإجراء مزيد من التجارب ، لأنها تغير الخصائص.</li>
	<li>جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام في RT لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من الوسط الخالي من الإكسوسوم وعد الخلايا.</li>
	<li>بذر الخلايا في 1.5-2.0 × 106 خلايا لكل طبق (15 سم) واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 ، 3٪ O2.</li>
	<li>اجمع الوسط المكيف بين 16-24 ساعة في أنابيب سعة 50 مل على الجليد. ملاحظة: إذا لم تكن الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ ، فيمكن إضافة وسط جديد خال من الظواهر الخارجية مرة أخرى وجمعها بعد فترة 16-24 ساعة إضافية. يمكن الجمع بين المجموعتين لمزيد من المعالجة.</li>
</ol>5. تنقية الإكسوسومات باستخدام الطرد المركزي التفاضلي والفائق
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات عند 4 درجات مئوية أو على الجليد. وازن الأنبوب بأنبوب مملوء بالماء عند الحاجة.
<ol><li>جهاز طرد مركزي الوسط المكيف عند 300 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا الحية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.</li>
	<li>قم بإزالة الخلايا الميتة عن طريق الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق ونقل المادة الطافية إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 38.5 مل.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي للطاف عند 10000 × جم لمدة 30 دقيقة لإزالة العضيات والأجسام المبرمج وشظايا الغشاء. انقل المادة الطافية إلى أنبوب فائق الوضوح سعة 38.5 مل.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي الفائقة الطافية عند 100000 × جم لمدة 1.5 ساعة لتكوير الإكسوسومات.</li>
	<li>تخلص بعناية من المادة الطافية ، واترك حوالي 1 مل من الوسط المكيف ، واغسل الحبيبات الخارجية بحجم إجمالي قدره 30 مل من برنامج تلفزيوني بارد مثلج.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي عند 100000 × جم لمدة 1.5 ساعة وتخلص بعناية من المادة الطافية عن طريق السحب ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات الخارجية.</li>
	<li>أعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني بارد (~ 25 ميكرولتر لكل طبق 15 سم) وقم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA وقارئ الصفائح الدقيقة عند 562 نانومتر. ملاحظة: يتم قياس تركيز البروتين بتخفيف 1: 2 مع 0.1٪ Triton-X100 في dH2O. إن ناتج الإكسوسومات من طبق 15 سم (20 مل من الوسط المكيف) من الخلايا الليفية الأولية عند التقاء 80٪ هو ~ 3-4 ميكروغرام.</li>
</ol>6. توصيف الإكسوسومات بواسطة تدرج كثافة السكروز
<ol><li>قم بتحميل تدرج السكروز في أنبوب فائق الوضوح سعة 13 مل عن طريق سحب (من الأسفل إلى الأعلى) ما يلي: 1.5 مل من 2.0 م ، 2.5 مل من 1.3 م ، 2.5 مل من 1.16 م ، 2.0 مل من 0.8 م ، و 2.0 مل من 0.5 م محاليل السكروز.</li>
	<li>امزج 30-100 ميكروغرام من الإكسوسومات بمحلول السكروز 0.25 متر واضبط الحجم على 1 مل.</li>
	<li>قم بتحميل الإكسوسومات الموجودة أعلى التدرجات بعناية وأجهزة الطرد المركزي الفائقة العينات لمدة 2.5 ساعة عند 100000 × جم و 4 درجات مئوية.</li>
	<li>قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الفائق وضعها على الجليد واجمع 1.0 مل من الكسور بدءا من أعلى الانحدار. نقلها إلى أنابيب 1.7 مل على الجليد.</li>
	<li>أضف 110 ميكرولتر من TCA بنسبة 100٪ إلى كل أنبوب ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لمدة 10 دقائق في RT.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 10000 × g و RT وتخلص بعناية من المادة الطافية.</li>
	<li>أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من الإيثانول المبرد مسبقا بنسبة 80٪ واترك العينات تغسل لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 10000 × جم و 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.</li>
	<li>جفف الحبيبات لمدة 10-15 دقيقة في RT وأعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني للتجارب في المختبر. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة بروتين BCA أو أعد تعليق الحبيبات مباشرة في 14.5 ميكرولتر من dH2O ، و 5 ميكرولتر من 4x Laemmli buffer ، و 0.5 ميكرولتر من 1 M DTT لتحليلات اللطخة الغربية.</li>
</ol>7. الكشف عن Exosome عن طريق تحليل اللطخة الغربية
<ol><li>امزج 5-10 ميكروغرام من الإكسوسومات من الخطوة 5.7 مع 5 ميكرولتر من 4x Laemmli buffer ، و 0.5 ميكرولتر من 1 M DTT ، ثم اضبط الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر مع dH2O. سخني جميع العينات ، بما في ذلك تلك الموجودة في الخطوة 6.9 ، لمدة 5 دقائق عند 98 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بتحميل العينات في جل خال من البقع بنسبة 10٪ TGX وقم بتحميل سلالم البروتين وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. ملاحظة: اختر النسبة المئوية للهلام وفقا للوزن الجزيئي للبروتين محل الاهتمام.</li>
	<li>قم بتشغيل الجل عند 100 فولت لمدة ~ 1 ساعة في تشغيل المخزن المؤقت حتى تصبح صبغة التحميل في الجزء السفلي من الجل. ملاحظة: قد يختلف وقت التشغيل وفقا للمعدات المستخدمة أو نوع الجل ونسبته.</li>
	<li>صورة الجل. تستخدم صور المواد الهلامية الخالية من البقع كعنصر تحكم في تحميل البقع المناعية.</li>
	<li>انقل الجل باستخدام غشاء PVDF لمدة 1.5 ساعة عند 80 فولت أو طوال الليل عند 30 فولت عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>سد الأغشية في سد العازلة لمدة 1 ساعة في RT.</li>
	<li>احتضان الأغشية لأجسام مضادة محددة (الجدول 2) في مخزن الأجسام المضادة طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع التقليب.</li>
	<li>غسل الأغشية في العازلة الغسيل واحتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (الجدول 2) لمدة 1 ساعة في RT مع الإثارة.</li>
	<li>اغسل الأغشية في المخزن المؤقت للغسيل وصور الأغشية باستخدام محلول تطوير وتصوير قائم على الكاميرا. بدلا من ذلك ، استخدم فيلم الأشعة السينية لتطوير الأغشية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Extracellular+Vesicles,+Their+Origin,+Composition,+Purpose,+and+Methods+for+Exosome+Isolation+and+Analysis.">Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Isolation,+Characterization,+Biological+Function,+and+Multifarious+Therapeutic+Approaches+of+Exosomes.">Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.</a> Cells. 8 (4), 307 (2019).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+biogenesis,+biologic+function+and+clinical+potential.">Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential.</a> Cell &amp; Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).</li><li>van de Vlekkert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+exosome+release+is+the+pathogenic+pathway+linking+a+lysosomal+deficiency+to+generalized+fibrosis.">Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis.</a> Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).</li><li>Rackov, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicle-Mediated+Control+of+Cell+Function:+The+Role+of+Extracellular+Matrix+and+Microenvironment.">A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment.</a> Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases.">Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+renal+fibrosis.">The role of extracellular vesicles in renal fibrosis.</a> Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).</li><li>Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+role+of+extracellular+vesicles+and+exosomes+in+the+pathogenesis+of+cystic+fibrosis.">Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis.</a> Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).</li><li>Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+exosomes+in+liver+physiology+and+pathology.">Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology.</a> Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).</li><li>Machado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+exocytosis+mediates+cancer+progression.">Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression.</a> Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).</li><li>Tian, W., Liu, S., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+exosomes+in+cancer+metastasis.">Potential role of exosomes in cancer metastasis.</a> Biomed Research International. , 4649705 (2019).</li><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+disease.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease.</a> Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., Gonz&#225;lez-Valdez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+challenges+in+the+recovery+and+purification+of+cellular+exosomes.">Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes.</a> Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mitochondria+from+Minimal+Quantities+of+Mouse+Skeletal+Muscle+for+High+Throughput+Microplate+Respiratory+Measurements.">Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).</li><li>. Muscle Dissection in mouse Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8">https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8</a> (2016)</li><li>Mas-Bargues, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+oxygen+concentration+in+stem+cell+culture+for+regenerative+medicine.">Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).</li><li>Bois, P. R., Grosveld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKHR+(FOX01a)+is+required+for+myotube+fusion+of+primary+mouse+myoblasts.">FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts.</a> The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).</li><li>Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+muscle+progenitor+cells+have+decreased+proliferation+and+myotube+formation+during+passages.">Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages.</a> Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+tissue+engineering.">Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).</li></ol>

ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة للعزل الناجح للإكسوسومات من وسائط الاستزراع ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، في إنشاء وصيانة مزارع الخلايا الليفية الأولية للفأر من العضلات الهيكلية البالغة. يجب الحفاظ على هذه الثقافات عند مستوى أكسجين منخفض لضمان ظروف شبيهة بالفسيولوجية (مستوى O 2 في العضلات الهيكلية هو ~2.5 ٪)15. ستتغير خصائص الخلايا الليفية الأولية عند تمريرها في الثقافة عدة مرات. ومن ثم ، فإن رقم المرور المنخفض أمر ضروري للحصول على عائد خارجي مثالي. يجب استخدام الإكسوسومات المنقاة على الفور لأغراض تجريبية أو الاحتفاظ بها مجمدة في القسمة عند -80 درجة مئوية لحين الحاجة. خطوة أخرى مهمة في البروتوكول هي استخدام محاليل السكروز المحضرة طازجة في كل مرة. أحد قيود هذه الطريقة هو أنها تستغرق وقتا طويلا ، لأن الخلايا الليفية الأولية لا تفرز عموما كميات كبيرة من الإكسوسومات ، مثل الخلايا الإفرازية الأخرى. لذلك ، يجب استخدام الثقافات الكبيرة ، مما يؤدي إلى معالجة كميات كبيرة من الوسائط المكيفة.
ميزة الطرد المركزي التفاضلي المستخدم هنا هي أنه يمثل نهجا قابلا للتطوير (حتى لترات) وهو الطريقة المفضلة لعزل الإكسوسومات عن الخلايا الليفية الأولية. طريقة بديلة للأحجام الأكبر (حتى 100 مل لكل عمود) هي كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). هذه الطريقة سريعة ويمكنها فصل البروتينات عن الإكسوسومات. لا يحتوي العمود على حبيبات exosomes ، لذلك يلزم المزيد من خطوات التركيز أو الطرد المركزي. أحد عيوب طريقة SEC هو أنه يمكن انسداد العمود بمرور الوقت وتحميله بشكل زائد. تعتمد الطرق الحالية الأخرى على استخدام كميات صغيرة من السوائل البيولوجية (مثل البول ، السائل الدماغي الشوكي ، المصل ، البلازما) والمجموعات المتاحة تجاريا. على الرغم من أن هذه المجموعات تضمن قابلية التكاثر ، إلا أنها مكلفة ولا تنتج دائما غلة عالية من الإكسوسومات النقية. البروتوكول المحدد لتنقية الإكسوسوم واضح ومباشر ويمكن تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا أو الأنسجة والأعضاء الكاملة أو السوائل البيولوجية الأخرى حسب الحاجة التجريبية.

Exosomes هي حويصلات خارج الخلية غير متجانسة يتراوح حجمها من 30-150 نانومتر. يتم تأسيسها لاعبين رئيسيين في العمليات الفسيولوجية والمرضية ، بالنظر إلى توزيعها في كل مكان في الأنسجة والأعضاء 1,2. تحمل الإكسوسومات شحنة معقدة من البروتينات والدهون وأنواع الحمض النووي وأنواع الحمض النووي الريبي ، والتي تختلف وفقا لنوع الخلايا التي اشتقت منها1،2،3. يتم إثراء الإكسوسومات في البروتينات التي لها وظائف مختلفة (أي أن التتراسبانين ، بما في ذلك CD9 و CD63) هي المسؤولة عن أحداث الاندماج. على سبيل المثال ، تشارك بروتينات الصدمة الحرارية HSP70 و HSP90 في ربط المستضد وعرضه. بالإضافة إلى ذلك ، يشارك Alex و Tsg101 والأسطول في التكوين الحيوي للإكسوسوم وإطلاقه ويستخدم على نطاق واسع كعلامات لهذه الحويصلاتالنانوية 2،3،4.
تحتوي الإكسوسومات أيضا على مجموعة متنوعة من الحمض النووي الريبي (مثل الحمض النووي الريبي الميكروي ، والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر ، والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي) التي يمكن نقلها إلى الخلايا المتلقية ، حيث تؤثر على إشارات المصب3. نظرا لكونه محاطا بغشاء وحدة واحدة ، فإن النشاط الحيوي الخارجي لا يعتمد فقط على شحنة البروتينات والأحماض النووية ، ولكن أيضا على المكونات الدهنية للغشاء المحدد1. يتم إثراء الأغشية الخارجية بالفوسفاتيديل سيرين وحمض الفوسفاتيديك والكوليسترول والسفينغوميلين وحمض الأراكيدونيك والأحماض الدهنية الأخرى ، وكلها يمكن أن تؤثر على استقرار الإكسوسوم وطوبولوجيا الغشاء 2,3. نتيجة لترتيب الشحن والدهون ، تبدأ الإكسوسومات مسارات الإشارات في الخلايا المستقبلة وتشارك في الحفاظ على فسيولوجيا الأنسجة الطبيعية1،2،4،5. في ظل ظروف مرضية معينة (مثل التنكس العصبي والتليف والسرطان) ، فقد ثبت أنها تحفز وتنشر المحفزات المرضية4،6،7،8،9،10،11.
نظرا لقدرتها على نشر الإشارات إلى المواقع المجاورة أو البعيدة ، أصبحت exosomes مؤشرات حيوية قيمة لتشخيص أو تشخيص حالات المرض. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام exosomes تجريبيا كمركبات للمركبات العلاجية 2,12. إن التطبيق المحتمل لهذه الحويصلات النانوية في العيادة يجعل طريقة العزل ذات أهمية متزايدة من أجل تحقيق أقصى قدر من الغلة والنقاء والتكاثر. تم تطوير وتنفيذ تقنيات مختلفة لعزل الإكسوسومات. بشكل عام ، يمكن عزل الإكسوسومات من وسائط زراعة الخلايا المكيفة أو سوائل الجسم عن طريق الطرد المركزي التفاضلي ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، والتقاط المناعة (باستخدام المجموعات المتاحة تجاريا). كل نهج له مزايا وعيوب فريدة تمت مناقشتها سابقا1،2،13،14.
يركز البروتوكول المبين على 1) عزل وزراعة الخلايا الليفية الأولية من عضلة الساق الفأر البالغة و 2) تنقية وتوصيف الإكسوسومات التي تطلقها هذه الخلايا في وسط الثقافة. لا يوجد حاليا بروتوكول راسخ لعزل الإكسوسومات من الخلايا الليفية الأولية للدراسات الوظيفية. لا تفرز الخلايا الليفية الأولية كميات كبيرة من الإكسوسومات ، مما يجعل عملية العزل والتنقية صعبة. يصف هذا البروتوكول تنقية كميات كبيرة من الإكسوسومات النقية من أحجام كبيرة من الثقافة مع الحفاظ على سلامتها المورفولوجية ونشاطها الوظيفي. تم استخدام الإكسوسومات المنقاة التي تم الحصول عليها من وسط مكيف بنجاح في تجارب الامتصاص في المختبر للحث على مسارات إشارات محددة في الخلايا المتلقية. كما تم استخدامها للتحليلات البروتينية المقارنة للشحنات الخارجية من عينات بيولوجية متعددة4.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific, TPP</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620659/5427754008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>11 213 857 001</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Millipore/Sigma, Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion Blotter with plate electrodes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX stain-free protein gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5678034</td>
			<td>10% 18-well, midi-gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion vertical electrophoresis cell (midi)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>NC0165100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>04 942 078 001</td>
			<td>neutral protease, grade II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma/Millipore, Roche</td>
			<td>10708984001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification Eagles Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluostar Omega multi-mode microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63052-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>LabScientific</td>
			<td>M-0842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2/CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MC0-18M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Midwest Scientific</td>
			<td>AVSC1510</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected disposable scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer (70 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher brand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal west Femto</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>16110734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-centrifuge Optima XPM</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tube (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tubes (25x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Isotemp 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts

الإكسوسومات هي حويصلات صغيرة خارج الخلية تفرزها جميع الخلايا تقريبا وتفرز في جميع السوائل الحيوية. تم تطوير العديد من الطرق لعزل هذه الحويصلات ، بما في ذلك الطرد المركزي الفائق والترشيح الفائق وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. ومع ذلك ، ليست كلها مناسبة لتنقية وتوصيف exosome على نطاق واسع. يوضح هنا بروتوكول لإنشاء مزارع الخلايا الليفية الأولية المعزولة من عضلات الهيكل العظمي للفأر البالغ ، يليه تنقية وتوصيف الإكسوسومات من وسائط زراعة هذه الخلايا. تعتمد الطريقة على استخدام خطوات الطرد المركزي المتسلسلة متبوعة بتدرجات كثافة السكروز. ثم يتم التحقق من نقاء المستحضرات الخارجية من خلال تحليلات اللطخة الغربية باستخدام بطارية من العلامات الكنسية (مثل Alix و CD9 و CD81). يصف البروتوكول كيفية عزل وتركيز الإكسوسومات النشطة بيولوجيا للمجهر الإلكتروني ، وقياس الطيف الكتلي ، وتجارب الامتصاص للدراسات الوظيفية. يمكن بسهولة توسيع نطاقه أو تقليله وتكييفه لعزل الإكسوسوم من أنواع الخلايا والأنسجة والسوائل البيولوجية المختلفة.

هذا البروتوكول مناسب لتنقية الإكسوسومات من كميات كبيرة من الوسط المكيف بطريقة فعالة من حيث التكلفة. الإجراء قابل للتكرار للغاية ومتسقة. يوضح الشكل 1 صورة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) للإكسوسومات المنقاة من وسط زراعة الخلايا الليفية الأولية للفأر. يوضح الشكل 2 نمط التعبير البروتيني للعلامات الخارجية المتعارف عليها ، وغياب ملوثات البروتين الخلوية (LDH) و ER (calnexin). يوضح الشكل 3 توزيع العلامات الخارجية المتعارف عليها (Alix و CD9 و CD81) بعد تدرجات كثافة السكروز.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61127/61127fig1v2.jpg"> الشكل 1: صورة TEM تمثيلية للإكسوسومات المعزولة من وسط زراعة الخلايا الليفية الأولية للفأر. تظهر الأحجام المنتظمة نسبيا لهذه الحويصلات النانوية. عبر الخطوط السوداء تدل على قطر الحويصلات الفردية. شريط المقياس = 100 نانومتر. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61127/61127fig1v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61127/61127fig2v2.jpg"> الشكل 2: البقع المناعية لمحللات الإكسوسوم التي تم فحصها بالأجسام المضادة ضد علامات الإكسوزوم والخلايا الخلوية وعلامات ER. علامات أليكس ، CD81 ، CD9 ، فلوتيلين 1 ، سينديكان 1 ، سينتينين 1 (إكسوسوم) ، سيتوسوليك (LDH) ، و ER (كالنيكسين). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61127/61127fig2v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61127/61127fig3v2.jpg"> الشكل 3: الإكسوسومات مفصولة بتدرج كثافة السكروز. تم فحص الكسور الفردية على لطخة غربية بأجسام مضادة ضد Alix و CD9 و CD81. استنادا إلى نمط تجزئة العلامات ، ترسب الإكسوسومات باستمرار في الكسور 3-6 ، والتي تتوافق مع كثافات 1.096-1.140 جم / مل. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61127/61127fig3v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>السكروز (غ)</td>
			<td>محلول عمل السكروز (مل)</td>
		</tr><tr><td>2.0 م</td>
			<td>2.74</td>
			<td>4.0</td>
		</tr><tr><td>1.3 م</td>
			<td>2.67</td>
			<td>6.0</td>
		</tr><tr><td>1.16 م</td>
			<td>2.38</td>
			<td>6.0</td>
		</tr><tr><td>0.8 م</td>
			<td>1.37</td>
			<td>5.0</td>
		</tr><tr><td>0.5 م</td>
			<td>0.86</td>
			<td>5.0</td>
		</tr><tr><td>0.25 م</td>
			<td>0.26</td>
			<td>3.0</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: محاليل تدرج كثافة السكروز.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>جسم</td>
			<td>مضيف</td>
			<td>شركة</td>
			<td>رقم الكتالوج</td>
		</tr><tr><td>سي دي 9</td>
			<td>جرذ</td>
			<td>بكالوريوس العلوم البيولوجية</td>
			<td>553758</td>
		</tr><tr><td>سي دي 81</td>
			<td>فأر</td>
			<td>سانتا كروز للتكنولوجيات الحيوية</td>
			<td>SC-166029</td>
		</tr><tr><td>اليكس</td>
			<td>أرنب</td>
			<td>مختبر دازو</td>
			<td>اليكس</td>
		</tr><tr><td>فلوتلين1</td>
			<td>فأر</td>
			<td>بكالوريوس العلوم البيولوجية</td>
			<td>610820</td>
		</tr><tr><td>سينديكان1</td>
			<td>أرنب</td>
			<td>تقنيات الحياة</td>
			<td>36-2900</td>
		</tr><tr><td>سينتينين1</td>
			<td>أرنب</td>
			<td>ميليبور / سيغما</td>
			<td>AB15272</td>
		</tr><tr><td>LDH</td>
			<td>ماعز</td>
			<td>كيميكون</td>
			<td>AB1222</td>
		</tr><tr><td>كالنيكسين</td>
			<td>ماعز</td>
			<td>سانتا كروز للتكنولوجيات الحيوية</td>
			<td>SC-6465</td>
		</tr><tr><td>الجرذان-HRP</td>
			<td>حمار</td>
			<td>جاكسون إيم. مختبر الدقة</td>
			<td>112-035-003</td>
		</tr><tr><td>الماوس-HRP</td>
			<td>ماعز</td>
			<td>جاكسون إيم. مختبر الدقة</td>
			<td>115-035-044</td>
		</tr><tr><td>أرنب-HRP</td>
			<td>ماعز</td>
			<td>جاكسون إيم. مختبر الدقة</td>
			<td>111-035-144</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: الأجسام المضادة الأولية والثانوية.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts at JoVE.com

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

يوضح هذا البروتوكول 1) عزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية من عضلة الساق الفأر البالغة وكذلك 2) تنقية وتوصيف الإكسوسومات باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي جنبا إلى جنب مع تدرجات كثافة السكروز تليها تحليلات اللطخة الغربية.

عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

isolation-characterization-exosomes-from-skeletal-muscle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

3.3K Views.  St. Jude Children's Research Hospital. يوضح هذا البروتوكول 1) عزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية من عضلة الساق الفأر البالغة وكذلك 2) تنقية وتوصيف الإكسوسومات باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي جنبا إلى جنب مع تدرجات كثافة السكروز تليها تحليلات اللطخة الغربية.

Video: Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

الميتوكوندريا من عزل العضلات والهيكل العظمي

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

عزل وتوصيف المحتوية على الحمض النووي الريبي Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

عزل وتوصيف Microvesicles من الدم المحيطي

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

عزل الميتوكوندريا سليمة من العضلات الهيكلية التي كتبها التفاضلية الطرد المركزي لقياسات عالية الدقة قياس التنفس

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...