بروتوكولنا يمكننا من تحديد كمي ميكروبي بشكل قوي مباشرة في موطنهم الأصلي. وبالتالي يمكننا عزل الكائنات الدقيقة ويمكننا تحديد وفهم أفضل لإمكانات التمثيل الغذائي. في الموقع chemotaxis المقايسة ، أو ISCA باختصار ، هو مرن ، وسهلة الاستعمال ، وجهاز بسيط يسمح بنظرة جديدة في السلوكيات الميكروبية ، وبالتالي دور ووظيفة الكائنات الحية الدقيقة في أي بيئة لديها مرحلة السائل.
ومن بين البرهان على إجراءات النشر في كل من المختبر والميدان، هي إستيل كليرك، التي تعمل حالياً طالبة دكتوراه في مجموعتي البحثية. قبل إعداد الكيميائي، تصفية المتوسطة مع مرشح ميكرومتر 0.2، وtingave الحل تصفية. بعد ذلك، قم بإعداد محلول 10 ملليمولار من الكيميمواتراكات في 1 ملليلتر من الوسيط العقيم، وتصفية محلول كيموماتراكستانت مع مرشح حقنة ميكرومتر 0.2 لإزالة أي جزيئات والملوثات المحتملة.
ثم، تمييع محلول الأسهم الكيميائي المصفى في سلسلة، وفقا للبروتوكول التجريبي. لملء ISCA، إرفاق إبرة قياس 27 إلى حقنة 1 ملليلتر، وتحميل حقنة واحدة لكل تركيز من chemoattractant المصفاة. عقد الجهاز مع منفذ تواجه صعودا، وحقن ببطء كل تركيز من المادة في كل من الآبار الخمسة من صف واحد من الجهاز حتى تظهر قطرات صغيرة على رأس كل منفذ.
عندما تم ملء جميع الآبار، نقل 1.5 ملليلتر من ثقافة البكتيريا البحرية أو المياه العذبة التي تهم في 150 ملليلتر من الوسيلة المناسبة للثقافة البكتيرية. بعد ذلك، ضع قطعتين صغيرتين من الشريط اللاصق على الوجهين على السطح المسطح لصينة سعة 200 ملليلتر. وتأمين واحدة ISCA على كل قطعة من الشريط.
باستخدام ماصات مصلي 50 ملليلتر، املأ درج النشر بالمحلول البكتيري ببطء. والسماح للبكتيريا للرد على chemoattractant من الفائدة لمدة ساعة واحدة. لإنهاء التحليل، استخدم ماصة جديدة 50 ملليلتر لإزالة الوسيطة بلطف من علبة ISCA.
لاسترداد العينات، ضع أولاً ISCA بحيث يواجه المنفذ لأسفل. بعد ذلك ، استخدم حقنة معقمة 1 ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 27 لرسم الحل من كل بئر. سحب العينات من كل صف من نفس التركيز في أنبوب واحد.
ثم، تحليل العينات عن طريق تدفق قياس التحلل لتحديد عدد البكتيريا التي جذبت إلى كل تركيز تشيمواتراكاتانت. لإعداد ISCA للنشر الميداني ، أولا ، جمع 5 ملليلتر من المياه لكل ISCA من جانب الحقل وتصفية المياه من خلال مرشح حقنة ميكرومتر 0.2 في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. تمرير المياه المحقة من خلال خرطوشة فلتر سباق الجائزة الكبرى المائية مرتين، وجمع الترشيح في أنبوب جديد 50 ملليلتر الطرد المركزي المخروطية، بعد كل شطف.
ثم، تصفية المياه من خلال مرشح حقنة ميكرومتر 0.02 في أنبوب جديد 50 ملليلتر. استخدام aliquots من الترشيح لإعادة تعليق جميع chemoattractants من الفائدة إلى التركيزات المطلوبة في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية. ثم استخدام 10 ملليلتر الحقن لتصفية resuspended chemoattractants من خلال الفردية 0.2 ميكرومتر مرشحات حقنة في أنابيب أجهزة الطرد المركزي مخروطية 15 ملليلتر معقم لإزالة أي جزيئات غير مرغوب فيها أو مركبات المياه غير قابلة للذوبان.
للنشر الميداني ISCA، المسمار كل ISCA على قطعة 9 من الضميمة الجهاز وإغلاق الضميمة. ختم العلبة مع شريط لاصق واستخدام الحبال بانجي لتأمين الضميمة إلى ذراع النشر وهيكل الإنسان. وبدلاً من ذلك، يمكن تأمين العلبة بوزن صغير على طبقة ضحلة أو تعلق على شبكة في المحيط البحري.
غمر العلبة تمامًا لبدء الحشوة ، وعقد العلبة بحزم لمنع حركة المياه المفرطة في الداخل. بمجرد وصول مستوى الماء إلى أعلى العلبة ، تأكد من عدم وجود هواء في الداخل. عندما تكون العلبة ممتلئة تمامًا ، فقم بختم الثقوب السفلية والعافلة باثنين من المقابس.
ثم اترك ISCA في مكانه لمدة 1 إلى 3 ساعات. في نهاية فترة أخذ العينات، قم بإزالة العلبة من الماء. ضع العلبة فوق حاوية لتصريف المياه، وإزالة الجزء العلوي من الشريط اللاصق من الثقوب الأمامية بعناية.
مرة واحدة وقد مرت خط المياه تحت الجزء العلوي من ISCA، وإزالة المكونات السفلي واستنزاف بقية المياه. في حين لا تزال الـ ISCAs متصلة بالضميمة، استخدم ماصة ملليلتر واحدة، أو حقنة ملليلتر واحدة، لإزالة المياه العالقة بعناية فوق كل ISCA وإزالة ISCAs دون لمس السطح العلوي. ثم استخدم مسحاً يمكن التخلص منه لإزالة أي سائل متبقي على السطح، واسترد العينات كما هو موضح لاسترجاع العينة المختبرية.
في هذا التحليل التمثيلي في المختبر، تم تحديد 1 مليمولار ليكون تركيز توزيع الجلوتامين الأمثل لأنه تسبب في استجابة كيموموية كبيرة كانت أعلى بمقدار 18 ضعفًا من التحكم في مياه البحر المصفاة. أعلى وأقل تركيزات الجلوتامين أيضا تسبب استجابة كبيرة، ولكن أضعف، العلاج الكيميائي. وفي تحليل الانتشار الميداني هذا، تم نشر خمسة تحاليل من التحاليل الإيكوسية (ISCA) مملوءة بـ 1 مليمولار الجلوتامين لمدة ساعة واحدة في موقع ساحلي بالقرب من سيدني، أستراليا.
وجذبت الغلوتامين المملوءة بـ ISCA بكتيريا أكثر بثلاث مرات تقريبًا من آبار التحكم المليئة بمياه البحر المصفاة. أهم شيء يجب تذكره عند نشر ISCA ، سواء في المختبر أو في الميدان ، هو تجنب خلق تدفقات سائل قوية من شأنها منع chemotaxis. ويمكن استخدام العينات المستمدة من هذا التصنيف لتحديد كائنات أو جينات محددة، وتوصيف الإمكانيات الجينية للكائنات الكيميائية، وللعزل المستهدف لسلالات محددة على وسائط معينة.
