هذا البروتوكول يمكّن الباحثين من تحليل البكتيريا التي تزرع في ظل الظروف التي تحاكي بشكل أوثق تلك الموجودة في مضيف الثدييات ، والتي هي معدن محدود من خلال عملية تسمى المناعة الغذائية. يسهل هذا البروتوكول توليد نمو البكتيريا القابلة للاستنساخ في ظل ظروف معدنية مقيدة ويمكن تكييفها لنمو العديد من أنواع البكتيريا المختلفة. قبل يومين من بدء التجربة، سلسلة gonococcide من مخزونات الفريزر على لوحات متوسطة GC لاحتضان لا يزيد عن 24 ساعة في 37 درجة مئوية.
قبل 14 إلى 16 ساعة من تجربة النمو، شريحة لحم مستعمرات واحدة على لوحات متوسطة GC الطازجة. في يوم التجربة، إضافة خمسة إلى 10 ملليلتر CDM إلى 125 ملليلتر غسلها حمض قارورة الذراع الجانبية والحيرة واستخدام هذه الوسيلة لفارغة كليت colorimeter. استخدام القطن العقيمة يميل مسحة لتطعيم 20 وحدة كليت من آلية التنمية النظيفة من مستعمرات واحدة صحية.
جيل سليم Neisseria السيلان inoculuae للثقافة الفرعية في 96 لوحات جيدا لمجراة النمو السائل أمر بالغ الأهمية لنجاح جميع التجارب المصب. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية في 250 الثورات في الدقيقة الواحدة لمدة ساعة إلى ساعتين حتى تقريبية كتلة واحدة مضاعفة قبل تمييع الثقافات مع حجم كاف من CDM للوصول إلى نصف كثافة الثقافة الأولية. ثم، إعادة الثقافة إلى حاضنة اهتزاز.
لإعداد البروتينات المحملة بالمعادن، أضف محلول phoration إلى محلول transferrin البشري 10 ملليغرام لكل ملليلتر لتحقيق تشبع الحديد بنسبة 30٪.. إضافة المعدن من الفائدة إلى محلول البروتين بنسبة 15٪ من الالضباء للحصول على 25٪ تشبع. استخدام حقنة لإضافة البروتين المحملة المعدنية إلى كاسيت غسيل الكلى وs dialyze مقابل لترين من عازلة غسيل الكلى لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.
ثم، نقل الكاسيت إلى لترين من أربع درجات مئوية غسيل الكلى العازلة وs dialyze بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية لإزالة أي المعادن غير منضم. خلال مضاعفة الشامل ، وتمييع قليلا 10X قبل يمزج من الفائدة مع برنامج تلفزيوني. علاج مسبق لآبار 96 جيدا microplate مع 15 ميكرولتردات من يمزج ما قبل المخفف وإضافة 10 ميكرولترات من 10X قبل المزيج و 90 ميكرولترات من آلية التنمية النظيفة إلى كل من الآبار الثلاثة للضوابط فارغة.
مرة واحدة الثقافات في قارورة الذراع الجانبية قد تضاعفت، إضافة 100 ميكرولترات من كل ثقافة إلى بئر غير المستخدمة في microplate وقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر. بعد حساب المبلغ الصحيح لتخفيف المطلوبة لتحقيق الثقافات إلى كثافة بصرية في 600 نانومتر من 0.02، وتمييع الثقافات مع آلية التنمية النظيفة في أنابيب ثقافة صغيرة وإضافة حجم كاف لتخفيف 10X قبل يمزج إلى 1X في لوحة. ثم ضع اللوحة في قارئ لوحة لمدة 8 إلى 12 ساعة مع اهتزاز للحصول على كثافة بصرية في 600 nanometers القراءات في فترات التجريبية المطلوب.
بعد ال مضاعفة شاملة مضاعفة حضانة, يرجع يخفّف الثقافات مع ثلاثة حجّم من آلية آلية وضيفت المعالجة معدنة من فائدة. ثم، احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لمدة أربع ساعات. قبل فترة وجيزة من علامة أربع ساعات، وقطع ثلاث قطع من ورقة تصفية وقطعة من nitrocellulose إلى الحجم التقريبي اللازم لتناسب جهاز نقطة لطخة.
قبل نقع النيتروسليلوز في المياه الأيونية لمدة 10 دقائق قبل تجميع الجهاز مع ورقة مرشح تحت النيتروسليلوز. في نهاية الحضانة، تسجيل كثافات الخلايا وتوحيد الكثافات إلى كثافة نهائية مناسبة. ثم، ماصة الثقافات الخلية على النيتروسليلوز.
عندما تمتص ورقة مرشح كل من تفكيك السائل الجهاز والسماح لتجف البقعة. منع الغشاء nitrocellulose لمدة ساعة واحدة مع حل منع المناسبة وإعادة تجميع جهاز نقطة لطخة، واستبدال ورقة مرشح مع فيلم البارافين لإنشاء ختم إثبات تسرب تحت النيتروسليلوز. تمييع المعادن ملزمة ligand من الفائدة إلى 0.2 ميكرومولار في مانع والتحقيق في الخلايا لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز معتدلة.
في نهاية الحضانة ، قم بتخشير السائل مع فراغ ، وغسل البقعة ، واتباع الإجراءات المناعية القياسية لتطوير الإشارة. ويكشف تحليل البقعة الغربية لإنتاج البروتين في تركيزات المعادن المتغيرة عن تنظيم الغشاء الخارجي للزنك استجابة للغشاء tdfJ استجابة لتجريب الزنك من قبل TPEN. TdfJ هو أساسا لا يمكن الكشف عنها عندما يضاف الزنك مرة أخرى إلى المتوسطة.
N.gonorrhoeae ينمو في وجود كالبروتيكتين الزنك محملة، الأمر الذي يتطلب عمل tdfH استجابة الزنك. عندما لا يتوفر مصدر الزنك القابل للاستخدام، يكون النمو مقيدًا. ويلاحظ نتائج مماثلة في وجود الزنك S100 A7، والتي يمكن أن تكون مصدرا للزنك الوحيد عند نقل الغشاء الخارجي، tdfJ، يتم إنتاج.
يستطيع المكوّن النيوكوسيد الذي يزرع في آلية التنمية النظيفة ربط الكولبروتيكتين عند إنتاج مادة الـ tdfH ونتيجة لندرة الزنك. ويلاحظ أيضاً تزايد ربط التحويل في الثقافات التي تزرع في آلية التنمية النظيفة، مما يدل على ارتفاع مستويات التعبير عن البروتين بسبب الطبيعة الأكثر نضباً من الحديد في آلية التنمية النظيفة مقارنة برقق GC المرشَّد. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام مع مصادر المياه الموصوفة، وسوف تكون هناك حاجة إلى معايرة إضافية مع chelators الأخرى أو المعادن إذا تم استخدام أنواع أخرى من المياه.
لمزيد من التحليل، يمكن إجراء مقايسات امتصاص المعادن الكمية أو رتبوري كمي لدراسات التعبير الجيني تحت المعادن المستنفدة أو ظروف معدنية تزخر.
