يمكن لهذه الطريقة الإجابة على السؤال الرئيسي حول دور الجهاز المناعي الفطري في عدوى الكلوستريديوم ، مثل إذا وكيف تتعرف الضامة أو البلعمية على هذا الممرض. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هو أنه يمكن تطبيقها على العديد من البكتيريا اللاهوائية المختلفة ، وأنه يمكن التلاعب بوقت العدوى ، وأن الإدارة عن طريق الفم تمثل العدوى البشرية الطبيعية أقرب بكثير. بعد زراعة, نقل ملليلتر واحد من الثقافة إلى cuvette الطيفي, وقياس OD600.
تحويل المبلغ المطلوب إلى أنبوب 1.5 ملليلتر جديدة من أجل الوصول إلى OD النهائي من واحد إلى 1.2 في ملليلتر واحد من الحجم النهائي. غسل مرة واحدة مع ملليلتر واحد من 1X PBS، والطرد المركزي في 5،000 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسوسينينيد في ملليلتر واحد من 1X PBS.
إضافة ثلاثة ميكرولترات من حل العمل من صبغة الفلورسنت المعدة في تعليق البكتيرية ملليلتر واحد. احتضان العينة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ذلك، غسل Difficile Clostridioides الملون مرة واحدة مع 1X PBS لإزالة الصبغة المتبقية، و resuspend في ملليلتر واحد من 1X PBS لتحقيق OD600 من 1.0.
أولاً، ضع قطرة بنسبة 0.8٪ من agarose منخفضة الذوبان على يرقات أسماك الحمار الوحشي في طبق بيتري لتغطية. ضبط بلطف اليرقات إلى موقف الجانبي. ضع طبق بيتري على الجليد لمدة 30 إلى 60 ثانية للسماح لأاروز منخفض الذوبان بالتوطد.
إضافة 30٪ Danieau المتوسطة التي تحتوي على 0.02٪ إلى 0.04٪ tricaine لتغطية agarose. لإعداد محلول الحقن، أضف ميكرولتر واحد من 0.5٪ فينول الأحمر في حل PBS في تسعة ميكرولترات من Clostridioides diffoculum الملون بصبغة. قم بتحميل إبرة الحقن المجهرية معايرة مع محلول الحقن باستخدام Microloader.
جبل الإبرة المحملة في ميكرومانيبولاتور، ووضعها تحت مجهر ستيريو. ضبط ضغط الحقن بين 600 و 900 هكتوباسكال. تعيين وقت الحقن إلى 0.1 إلى 0.3 ثانية للحصول على 0.5 إلى 1.0 نانولترات.
تعيين الإبرة في micromanipulator في زاوية 45 درجة تقريبا، مشيرا نحو اليرقات جزءا لا يتجزأ. ضع طرف الإبرة فوق الجهاز الهضمي، بالقرب من المسام البولي التناسلية. (اخترق من خلال (الاجاروز ثم العضلة مع طرف الإبرة
ثم إدراجه في تجويف الأمعاء، وحقن 0.5 إلى 1.0 نانولترات من Difficile Clostridioides. استخدم مجهر الفلورسينس لمراقبة اليرقات المحقونة، واستخدم طرف Microloader مرن لالتقاط اليرقات المحقونة بشكل صحيح للتصوير confocal. في لوحة agarose 1.5٪ مع الأخاقد، وضع قطرة من 0.8٪ agarose منخفضة الذوبان على يرقات سمك الحمار الوحشي لتغطية.
ضبط بلطف اليرقات مع رؤساء التي تواجه تستقيم في زوايا 45 درجة في الأخدود والذيول ضد جدار الأخدود. تشغيل الإبرة بلطف من خلال agarose، ثم في فم يرقات حمار وحشي، من خلال المريء. مرة واحدة غيض من الإبرة هو داخل لمبة الأمعاء الأمامية، اضغط على دواسة الحقن للافراج عن 0.5 إلى نانولترات واحد من ثقافة البكتيريا.
ملء تجويف الأمعاء. لا تدعها تفيض من المريء أو كلواكا. سحب بلطف إبرة من فم من الحمار الوحشي.
بعد gavage ، انقاذ يرقات حمار وحشي مصابة من agarose مع طرف Microloader مرنة عن طريق قطع أولا agarose بعيدا ، ثم عن طريق رفع اليرقات. نقل هذه اليرقات إلى وسيطة معقمة 30٪Danieau، وشطف مرتين. بعد تخدير يرقات سمك الحمار الوحشي ، أضف 200 إلى 300 ميكرولترات من agarose منخفضة الذوبان بنسبة 1٪لتغطية اليرقات المُغَذَّلة.
ضع المنطقة المصابة من اليرقات ضد شريحة زجاجية بأكبر قدر ممكن. دع الأاغروز يتجمد على الجليد لمدة 30 إلى 60 ثانية. غمر agarose في 30٪ Danieau المتوسطة التي تحتوي على 0.02٪ إلى 0.04٪tricaine.
المضي قدما في صورة اليرقات مع مجهر مسح الليزر confocal. بعد القتل الرحيم يرقات حمار وحشي مصابة، أدخل إبرة في الجذع الظهري ليرقات سمك الحمار الوحشي بالقرب من الرأس لشل حركة الحمار الوحشي. إزالة الرأس وراء الخياشيم مع lancet.
أدخل إبرة ثانية في منتصف الجذع الظهري. أدخل إبرة ثالثة في بطن سمك الحمار الوحشي، واسحب الأمعاء من تجويف الجسم. استخدم إبرة الحقن المجهري لنقل 10 إلى 15 أمعاء إلى أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على 200 ميكرولترات من PBS 1X معقم.
التجانس الأمعاء مع آفة لتعطيل الأنسجة وإعداد تجانس. تأكد من أن الآفة تصل إلى أسفل الأنبوب لتعطيل جميع الأمعاء تمامًا. في التجانس، إضافة Clostridioides difficile تربية المتوسطة التي تحتوي على D-cycloserine وcefoxitin، مع أو بدون taurocholate، واحتضان في غرفة اللاهوائية.
في هذه الدراسة، تصل كل من العدلات وال الضامة إلى مواقع العدوى. مثال على تنشيط الضامة البلعمة اثنين من البكتيريا يظهر تطهير بواسطة البلعميات والهضم من difficile Clostridioides المسمى. microgavage لتقديم الفلوريسين المسمى Clostridioides difficile في تجويف الأمعاء من الضامة وخطوط مراسل العدلات في خمسة أيام بعد الإخصاب يحاكي المسار الطبيعي للعدوى Difficile Clostridioides.
ومع ذلك، لم تظهر العدلات والضامة هجرة واضحة إلى الجهاز الهضمي لمدة تصل إلى 12 ساعة بعد الطحالب الدقيقة. في غضون ذلك، اختفت الفلوريسنس المسمى Clostridioides difficile بعد حوالي خمس ساعات بعد microgavage. تم تشريح عينات الأمعاء 24 ساعة بعد العدوى وأظهرت النمو البكتيري.
لم تنمو البكتيريا في مجموعة التحكم. في وقت لاحق من النقاط، نمت العينات المحتضنة فقط في المتوسطة التي تحتوي على TCA، مما يشير إلى أن مجموع Clostridioides difficile في الأمعاء قد شكلت الجراثيم. 16S rDNA PCR حددت البكتيريا المزروعة كما Difficile Clostridioides، والتي تنتج أمبيرليكونات PCR محددة من حجم يمكن التنبؤ بها حول أزواج قاعدة 800.
ظهرت ثقافات البكتيريا التي نمت على لوحة CHROMID كمستعمرات سوداء نموذجية ، مما يشير إلى أن البكتيريا من أمعاء سمك الحمار الوحشي كانت Clostridioides difficile. العمل مع البكتيريا اللاهوائية يتطلب أن يتم الاحتفاظ بالخطوات الهوائية قصيرة لأن ذلك يؤثر على بيولوجيا البكتيريا بالطبع. يمكن التلاعب بالخلية المناعية الفطرية في سمك الحمار الوحشي.
على سبيل المثال ، يمكنهم فك آلية استجابات الخلايا المناعية الفطرية للعدوى. أشارت طريقتنا إلى أن سمك الحمار الوحشي يمكن أن يكون أداة لدراسة مسببات الأمراض اللاهوائية من الأمعاء البشرية. ويتطلب العمل مع مسببات الأمراض المتعددة المقاومة اتخاذ تدابير السلامة المناسبة.
