يساعد هذا الأسلوب على التغلب على القيود في دراسة تطور الدم البشري من خلال توفير منصة بسيطة وقابلة للمسح في المختبر على أساس إعادة برمجة الخلايا المباشرة. سوف العرض المرئي لهذه الطريقة توفير التوجيه المثالي في الخطوات الأساسية لتوليد الخلايا الهيموجينية البشرية أي أثناء إنتاج العدس، والتناقلي الخلايا الليفية والخلايا. عن طريق تحويل الخلايا الليفية الجلدية إلى السلائف الهيموجينية، ونحن نأمل في توليد الجذعية البشرية محددة المريض والخلايا السلف بأعداد كافية لزرع الخلايا الجذعية.
تبدأ من خلال نمو خلايا HEK293T في 100 ملليمتر معالجة زراعة الأنسجة طبق مع 10 ملليلتر من DMEM كاملة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى التقاء. في اليوم السابق لTransfection، بعد التعرق المتوسطة، وغسل الطبق بعناية مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا مع 1.5 ملليلتر من محلول الانفصام. بعد احتضان لمدة خمس إلى 10 دقائق في 37 درجة مئوية، تعطيل الحل مع ثلاثة ملليلتر من DMEM كاملة ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
اغسل الطبق بـ 5 ملليلترات من DMEM كاملة لإزالة أي خلايا متصلة متبقية وسحب الغسيل مع محلول الخلية. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وpirate المابير و resuspend بيليه في ستة ملليلتر من DMEM كاملة. ثم، تقسيم التعليق بالتساوي بين ستة 100 ملليمتر ثقافة الأنسجة الأطباق المعالجة في حجم النهائي من 10 ملليلتر من DMEM كاملة لكل طبق.
في اليوم التالي، إضافة 10 ميكروغرام مجموع كتلة من البلازميدات نقل الثلاثة معا إلى أنبوب جديد مخروطي 15 ملليلتر. بعد ذلك ، إضافة 10 ميكروغرام من الجيل الثاني من ناقلات التعبئة والتغليف psPAX2 ترميز هفوة ، بول ، تات وrev الجينات تليها إضافة خمسة ميكروغرام من pMD2. G مُتجه الغلاف يُرِكّر جين VSV-G إلى الأنبوب.
وأخيرا، إضافة الماء لتحقيق حجم النهائي إلى 500 ميكرولترات. في اثنين من أنابيب المخروطية 15 ملليلتر جديدة، إضافة 10 ميكروغرام من FUW-M2rtTA plasmid، 10 ميكروغرام من ناقلات التعبئة والتغليف، وخمسة ميكروغرام من متجه المغلف إلى كل أنبوب. ثم، إضافة الماء إلى حجم النهائي من 500 ميكرولترات لكل أنبوب.
بعد ذلك، إضافة 62.5 ميكرولترات من اثنين من كلوريد الكالسيوم الضرس إلى كل من الأنابيب الثلاثة واستخدام وحدة تحكم ماصة مجهزة Pipette باستور لإطلاق فقاعات في كل خليط. في حين أن فقاعات تتشكل، إضافة 500 ميكرولترات من BES المخزنة سالكية قطرة ضد Pipette باستور وعلى الخليط. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل حتى تظهر الخلطات غائمة قليلا.
أثناء الحضانة، بعناية استبدال ناظر من الثقافات خلية HEK293T مع 10 ملليلتر من DMEM كاملة دون المضادات الحيوية. توزيع مجمعات الحمض النووي قطرة على الفردية HEK293T أطباق ثقافة الخلية واحتضان لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدل المُنبتات بأربعة ملليلترات من DMEM كاملة لكل ثقافة، ثم أعد الأطباق إلى حاضنة ثقافة ثاني أكسيد الكربون 5٪ خلية الكربون بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي، وجمع سراويل في أنبوب واحد 50 ملليلتر في الطبق الواحد وإضافة أربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى كل طبق. بعد ثماني ساعات أخرى من الثقافة، تجمع سوبرنات في كل طبق مع supernatant حصادها سابقا وإضافة أربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة. العودة أطباق إلى خلية ثقافة الحاضنة بين عشية وضحاها وجمع ااثقاف مرة واحدة في نهاية المطاف.
عندما تم جمع كل من الفيروس، تصفية كل عظمى العدسي الفيروسي من خلال 0.45 ميكرومتر منخفضة البروتين ملزمة فلتر في أنابيب الفردية وإضافة حد أقصى 15 ملليلتر من السوبر مصفى لوحدات تصفية الطرد المركزي الفردية للطرد المركزي. تجاهل التدفق من خلال. سيبقى فيروس العدس اللزوج الذي يحتوي على سائل في وحدة الفلتر.
عندما تم تصفية كل من عظمى العدسي الفيروسية aliquot 50 إلى 200 ميكرولترات من فيروسات العدسية المركزة للتخزين البارد. قبل البدء في إجراء إعادة البرمجة، رمز ستة ثقافة الأنسجة جيدا معالجة لوحة مع 500 ميكروليترس من 0.1٪ الجيلاتين في البئر واحتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، التعرق الحل الجيلاتين المتبقية.
لوحة الدم البشري الليفية في كثافة 1.5 مرات عشر إلى الخلايا الخامسة لكل لوحة في مليلترين من DMEM كاملة في بئر واحتضان بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، استبدال المتوسطة في كل بئر مع مليلترين من DMEM كاملة تكملها ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر البوليبرين وإضافة واحد إلى مزيج واحد من تجمع ينتج النسخ عامل العدسي وM2rtTA في أنبوب جديد microcentrifuge. ثم، transduce الخلايا الليفية مع حجم الأمثل من خليط العدسي، بين 10 إلى 100 ميكرولترات لكل بئر.
بعد 16 ساعة من الحضانة، استبدال اعمابير مع DMEM كاملة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ست إلى ثماني ساعات. بعد الانتعاش، استبدال superants مع مليلتر اثنين من DMEM كاملة تكمل مع البوليبرين وتنفيذ عملية نقل ثانية كما أظهرت للتو. في نهاية الحضانة الثانية، استبدال supernatants مع DMEM كاملة تكمل مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من الدوكسيسيكلين والعودة إلى لوحة الحاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة.
في نهاية الحضانة، وتقسيم كل بئر في نسبة واحد إلى اثنين والخلايا replate في مليلتر اثنين في بئر من متوسطة الدم تكملها دوكسيسيكلين في الجيلاتين المغلفة جديدة ستة لوحة جيدا. للحصول على عدد كاف من الخلايا لتحليل تسلسل chromatin المناعية، لوحة ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الليفية الخامسة في الجيلاتين المغلفة ستة لوحة جيدا واحتضان بين عشية وضحاها. في نهاية الحضانة، transduce الخلايا مرتين في يومين متتاليين مع 10 إلى 20 ميكرولترات من فيروس العدس التي تحتوي على العوامل الفردية من الفائدة أو مجموعة من العوامل الثلاثة بالإضافة إلى FUW-M2rtTA بنسبة واحد إلى واحد.
بعد 16 ساعة من عملية النقل الثانية، قم بإزالة الفيروس الذي يحتوي على افراً واحتضان الخلايا في DMEM كاملة لمدة 24 ساعة. في نهاية الحضانة، وإرجاع محتويات كل بئر في الجيلاتين المغلفة 100 ملليمتر الأطباق معالجة زراعة الأنسجة مع DMEM كاملة إلى حجم النهائي من 10 ملليلتر المتوسطة لكل طبق، والعودة إلى الخلايا الحاضنة ثقافة الخلية. بعد ستة أيام، استبدال ناظر مع DMEM كاملة تكمل مع الدوكسيسيكلين.
إعادة الثقافات إلى الحاضنة لمدة يومين إضافيين. كما تثبت هذه المؤامرات علم الخلايا تمثيلية، ما يقرب من 17٪ من الخلايا التي أعيد برمجتها التعبير عن كل CD49f و CD9 بعد 25 يوما من إعادة البرمجة. غالبية الخلايا الإيجابية المزدوجة تعبر عن CD143 ويعبر عدد قليل من السكان عن CD34 ، مما يشير إلى تحريض مصير الهيموجينيك الديناميكي.
لا يتم تنشيط هذه العلامات في M2rtTA الخلايا الليفية الجلدية المستحثة البشرية المستزرعة لمدة 25 يوما. ويؤكد التصوير المناعي للفلوريس التعبير عن CD9 وD143 في الخلايا المتصّفة والمستديرة التي تتميز بشكل مورفولوجي عن الخلايا الليفية، والتي تكون سلبية بالنسبة لهذه العلامات. يتم تنفيذ التصوير Brightfeild لتصور التقاء الخلية، مورفولوجيا، وتشكيل مستعمرة في جميع أنحاء عملية إعادة البرمجة.
تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية للخلايا التي أعيد برمجتها يكشف عن زيادة تدريجية في التعبير CD49f و CD9 و CD143 من يومين إلى 25. بعد تسلسل chromatin المناعية، يعرض لمحات متصفح الجينوم جاتا2 ملزمة للمناطق التنظيمية الجينومية من ITGA6 و ACE عندما يتم cotransations الليفية مع العوامل الثلاثة أو جاتا 2 بشكل فردي. وينبغي تحسين حجم الجسيمات المضادة للفيروسات المضافة إلى الثقافة لإعادة البرمجة بنجاح دون المساس بقابلية الخلية.
يمكن أن تقترن هذه المنصة مع التثبيط الدوائي وتقنيات الفحص على نطاق الجينوم ، مثل CRISPR -Cas9 ، لتحديد المنظمين رواية لدم الدم النهائي البشري. وهذا النهج إعادة برمجة مباشرة تسمح للباحثين لاستكشاف أسئلة جديدة في مجال الدم الإنسان التنموي وفك الآليات الكامنة في تحديد الخلايا الجذعية الإنسان. ومن المهم القيام بمجموعات مضادة للفيروسات وتحويلها في غطاء للتدفق المغفل مخصص للعمل في علم فيروسات الدسين والتخلص من النفايات الملوثة فيروسية في حاوية مناسبة.
