يسمح هذا البروتوكول بسرعة واختراق عالية الوقت والمخلوقة في الفضاء الجنينية في الخلايا الجذعية العصبية axolotl الحبل الشوكي لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الحبل الشوكي. هذه التقنية تسمح لدراسة وظيفة الجينات في الخلايا الجذعية العصبية، وتجديدها الطبي دون أن تكون مربكة من آثار النمو أو الآثار من أنواع الخلايا الأخرى. الخلايا الجذعية العصبية Axolotl تسهم إلى حد كبير في قدرتها على تجديد الحبال الشوكية.
يمكن أن يؤدي فهم آليات التجديد إلى رؤى لتطوير علاجات لإصابة الحبل الشوكي البشري. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة حول كيفية تركيب الخلايا الجذعية العصبية axolotl استجابة تجديدية لإصابة الحبل الشوكي. وضع بشكل صحيح في حقن الشعرية في العمود المركزي الحبل الشوكي يمكن أن يكون تحديا وممارسة على اختبار يساعد مع اتقان هذه التقنية.
يمكن عرض الإدارة تظهر كيفية إجراء الحقن وكيف تبدو الحقنة الناجحة. لإعداد دليل Cas9 الحمض النووي الريبي الريبينوسليار خليط البروتين، مزيج خمسة ميكروغرام من بروتين تسلسل التعريب النووي Cas9، وأربعة ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي دليل، و 0.9 ميكرولترات من 10X Cas9 العازلة. ثم جلب الحجم الإجمالي إلى 10 ميكرولترات مع المياه الخالية من النوى وتخزين Cas9 دليل الحمض النووي الريبي الريبوكوليار خليط البروتين في ناقص 80 درجة مئوية إذا لم تستخدم على الفور.
لإعداد لوحة الكهرباء agarose، وإعداد 200 ملليلتر من 2٪ agarose في برنامج تلفزيوني دولبيكو وحل الخليط في الميكروويف. بعد تبريد طفيف، صب agarose السائل في أطباق بيتري 10 سنتيمترات إلى عمق حوالي 10 ملليمترات والسماح لوحات لترسيخ في درجة حرارة الغرفة. عندما agarose هو شركة لمسة، واستخدام مشرط الجراحية لقطع شق في agarose كل طبق لعقد الذيل على التوالي، بئر لتناسب الجسم من الحيوان، واثنين من الآبار الإضافية لعقد الأقطاب الكهربائية.
ثم ضع اللوحات على الجليد وملئها إلى الحافة بـ DPBS الباردة. لتكوين الكهربائي، تعيين نبض ال poring إلى نبضة ثنائية القطب واحد في 70 فولت مع مدة من خمسة ميلي ثانية، فاصل زمني من 50 مللي ثانية، وعدم وجود اضمحلال الجهد. تعيين نبض نقل إلى أربع نبضات ثنائي القطب من 40 فولت مع مدة 50 مللي ثانية، فاصل من 999 مللي ثانية، وتسوس الجهد 10٪.
ثم قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية إلى المكهرب وضبط الملاقط بحيث تكون سبعة ملليمترات عن بعضها قبل غمر الأقطاب الكهربائية في منقار من برنامج تلفزيوني. لإعداد الزجاج micro-حقن الشعيرات الدموية, إجراء اختبار منحدر على جرة ميكروبليت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتحديد قيمة الحرارة. ثم سحب الشعيرات الدموية حقن مع نهايات مدببة مع المعلمات المشار إليها.
بعد سحب، واستخدام المجهر ستيريو والملباب غرامة لكسر شعري في زاوية بحيث يكون لها طرف مائل في موقف حيث طرف رقيقة بما يكفي لاستهداف القناة المركزية للعمود الفقري axolotl في حين تبقى قوية بما يكفي لثقب الجلد. قبل تحميل طرف، إضافة حل FCF الخضراء سريعة لخليط البروتين ribonuclear في نسبة واحد إلى 30 واستخدام تلميح ماصة هلام تحميل لتحميل حوالي خمسة ميكرولترات من مزيج الحقن في الشعيرات الدموية. ثم قم بتركيب الشعيرات الدموية على المضخة الهوائية مع الطرف المائل الذي يواجه الهبوط.
لتكوين مضخة هوائية، تعيين عقد إلى 0.5 جنيه لكل بوصة مربعة، والقذف إلى رطلين لكل بوصة مربعة عقد، ومدة إلى مسور. لاختبار إعدادات الشعيرات الدموية والمضخات، تراجع الشعيرية في قطرة من الماء واضغط على دواسة القدم لحقن. يجب أن يخرج مزيج الحقن في تيار بطيء ولكن ثابت.
لحقن خليط البروتين الريبوني، الوجه axolotls ليتم حقنها رأسا على عقب في الماء لتأكيد التسخين واستخدام ملقط حلقة لنقل واحد على سرير من السيليكون مع الجانب الأيسر من الحيوان التي تواجه لأعلى والذيل مشيرا إلى اليمين. ضع موقع الحقن في منتصف مجال الرؤية للمجهر الاستريو وضبط المايكرومانيبولاتور بحيث تدخل الشعيرات الدموية الحيوان بزاوية 60 درجة من الجانب الأيمن من مجال الرؤية. بعد تحديد الحبل الشوكي والقناة المركزية، قم بتحريك الشعيرات الدموية ببطء نحو القناة المركزية للنخاع الشوكي حتى تخترق الجلد والعضلات برفق.
عندما يكون الشعيرات الدموية في الموقف، اضغط باستمرار دواسة القدم لحقن الخليط في القناة المركزية. إذا تم وضع الشعيرات الدموية بشكل صحيح ، فإن خليط البروتين ribonuclear سينتشر على طول القناة المركزية كخط أزرق في كلا الاتجاهين. يمكن أن يكون تحديا لوضع الشعرية بشكل صحيح.
إذا لم ينتشر الخليط بشكل صحيح، اضبط وضع الشعيرات الدموية في خطوات صغيرة مع الحفاظ على لوحة القدم مضغوطة. الاستمرار في الاستمرار في الاستمرار على دواسة القدم حتى يصل الخليط إلى حويصلات المحطة الطرفية في نهاية الحبل الشوكي والبطينين في الدماغ. قد يكون من الضروري ضبط ضغط القذف أثناء الحقن.
مباشرة بعد الحقن، واستخدام ملقط حلقة لنقل الحيوان على لوحة الكهربائي agarose أعدت على الجليد ووضع الذيل داخل الشق بحيث تقع من قبل agarose. وضع الأقطاب الكهربائية في الآبار على جانبي الذيل، مع الحرص على أن يتم تغطية الحيوان بأكمله والأقطاب الكهربائية بواسطة PBS الجليد الباردة واضغط على مفتاح القدم لبدء electroporation. ثم العودة إلى الماء مع مراقبة الحيوان حتى الشفاء الكامل وحقن وكهرباء الحيوانات اللاحقة بنفس الطريقة.
لتقييم كفاءة خروج المغلوب على مستوى البروتين، والحصول على مقطع عرضي من الذيل وإجراء تحليل المناعة الوهistochemical وفقا للبروتوكولات القياسية. بدلا من ذلك ، استخراج الحبل الشوكي الكهربائي وlyse العينة للحصول على الحمض النووي. ثم قم بإجراء جينوتيبينغ PCR متبوعاً بتسلسل Sanger أو تسلسل الجيل التالي لتقييم النسبة المئوية للتحرير الجيني.
الحقن والكهرباء من مجمعات RNA دليل Cas9 ضد Sox2 في القناة المركزية للحبل الشوكي axolotl يؤدي إلى فقدان هائل للمناعة Sox2 في غالبية الخلايا الجذعية العصبية الحبل الشوكي مقارنة الحقن والكهرباء من مجمعات RNA دليل Cas9 ضد التيروزيناسي كتحكم. يكشف القياس الكمي للخلايا الإيجابية Sox2 في عينات قسم أنسجة الحبل الشوكي عن عدد مخفض بشكل كبير من الخلايا المعبرة عن Sox2 في Cas9 Sox2 دليل الحمض النووي الريبي الحيوانات الارتهابة، مما يشير إلى أن هذه الطريقة تؤدي إلى خروج جينات فعالة ومخترقة للغاية في الخلايا الجذعية العصبية الحبل الشوكي. بعد الحقن المتزامن وكهربة اثنين من مجمعات RNA دليل Cas9 ضد Sox2 وGFP في axolotls المعدلة وراثيا مع تعبير GFP في كل مكان ، لوحظت نسبة عالية من الخلايا الجذعية العصبية المزدوجة ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام البروتوكول لضرب جينات متعددة بمرونة.
من المفيد ممارسة استهداف القناة المركزية مع شعرية ووضع الصيغة مع خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها عندما لا يعمل الحقن كما هو متوقع. هذه التقنية تسمح للباحثين لدراسة وظائف الجينات في الخلايا الجذعية العصبية التي هي محددة للتجديد. الحرص عند التلاعب الشعرية وتأكد من عدم طعن أصابعك.
