يصف هذا البروتوكول طريقة لإعادة برمجة الدم والخلايا أحادية النوى للخلايا الجذعية العصبية التي يمكن استخدامها لعلاج الأمراض العصبية التنكسية، مثل مرض باركنسون. وهو يقدم مصدر خلية الذاتية لعلاج الأمراض العصبية. أيضا، الإطار الزمني اللازم للتحويل إلى الخلايا الجذعية العصبية المستحثة والتمايز إلى أنواع الخلايا المطلوبة أقصر من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات.
تمتلك الخلايا الجذعية العصبية المستحثة قدرة تكاثرية جيدة ويمكن توسيع نطاقها قبل التطبيق. وبما أنه يمكن تحديد الخلايا العصبية في مختلف الخلايا العصبية الخاصة بالمنطقة، مثل الخلايا العصبية الحبل الشوكي أو الخلايا العصبية الحركية، يمكن تمديد هذه الطريقة لعلاج الأمراض العصبية الأخرى. الإجراء كله يأخذ وقتا طويلا، مع جميع الخطوات ذات الصلة والحرجة، لذلك مظاهرة البصرية يعطي فكرة عن كيفية الخلايا تبدو وكأنها، ويقدم بعض النصائح لضمان جيل ناجح من الخلايا المطلوبة.
للبدء ، ونقل الدم الوريدي المحيطي المعزول سابقا إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ، وتمييعه مع حجم متساو من برنامج تلفزيوني دولبيككو العقيمة. في آخر 50 ملليلتر أنبوب مخروطي، وإعداد 15 ملليلتر من كثافة معقمة المتوسطة الانحدار. إمالة الأنبوب بزاوية 45 درجة، وببطء وبعناية وضع 30 ملليلتر من الدم المحيطي المخفف على متوسط الكثافة الانحدار.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 800 مرة ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الفرامل الطرد المركزي تعيين في موقف إيقاف. استلهم طبقة البلازما الصفراء والعليا، وتجاهلها. استخدم ماصة 10 ملليلتر لنقل طبقة رقيقة بيضاء غائمة تحتوي على خلايا أحادية النوى إلى أنبوب مخروطي جديد يبلغ 50 ملليلتر.
إضافة 30 ملليلتر من D-PBS إلى الأنبوب مع MNCs، والطرد المركزي في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المابير، إضافة 45 ملليلتر من برنامج تلفزيوني D و resuspend الخلايا. بعد الطرد المركزي للأنبوب في 400 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية، والتخلص من عظمى.
إعادة تثبيت الخلايا مع خمسة ملليلتر من D-PBS، عد الخلايا الحية مع طريقة الاستبعاد الأزرق trypan، جانبا MNCs اللازمة للتوسع، وتجميد الخلايا المتبقية للاستخدام في المستقبل. في اليوم ناقص 14، بذور MNCs في كثافة من 2-3 مليون خلية لكل ملليلتر في بئر من لوحة ستة جيدا مع 1.5 ملليلتر من 37 درجة مئوية، قبل الدافئة MNC المتوسطة. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين.
في اليوم ناقص 11، واستخدام ماصة معقمة لجمع الخلايا مع المتوسطة ونقلها إلى أنبوب مخروطي جديد 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 250 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، والتخلص من افر، وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من MNC المتوسطة قبل الدافئة. بعد عد الخلايا القابلة للحياة مع الأزرق trypan، بذور MNCs في كثافة مليون خلية لكل ملليلتر في MNC المتوسطة قبل warmed في لوحة ستة جيدا.
احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام، وتكرار جمع الخلايا، الطرد المركزي، والطلاء في MNC المتوسطة في الأيام ناقص ثمانية وناقص أربعة. Sendai فيروس في هذا الإجراء هو خطير، وجميع الإجراءات التي تنطوي على فيروس سينداي يجب أن يتم تنفيذها في خزانة السلامة. وينبغي أن تعامل جميع النصائح والأنابيب المعرضة لفيروس سينداي بالإيثانول أو التبييض قبل التخلص منها.
في اليوم صفر، وجمع الخلايا في المتوسط MNC ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. بعد الطرد المركزي للخلايا في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق، pirate supernatant و resuspend الخلايا مع ملليلتر واحد من MNC قبل الدافئة المتوسطة. عد الخلايا القابلة للحياة مع الأزرق trypan، ومن ثم إعادة تعليق لهم مع MNC قبل الدافئة المتوسطة إلى تركيز 200،000 الخلايا في بئر في لوحات 24-جيدا.
اذيب الأنابيب التي تمت إزالتها من التخزين ناقص 80 درجة مئوية التي تحتوي على فيروس سينداي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 ثوان، ثم تترك لهم للذوبان في درجة حرارة الغرفة. بمجرد إذابة، وضعها على الجليد على الفور. إضافة فيروس سينداي المذاب إلى آبار لوحة 24 بئراً مع الشركات متعددة الشركات في عدد كبير من العدوى من 10.
لتسهيل مرفق الخلايا، الطرد المركزي لوحات في 1،000 مرات ز لمدة 30 دقيقة وبعد ذلك وضع لوحات في الحاضنة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الأول، نقل الخلايا مع المتوسطة إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. لمزيد من فصل الخلايا المتبقية، شطف الآبار مع ملليلتر واحد من MNC المتوسطة في البئر وإضافة الخلايا مع المتوسطة إلى الأنبوب.
بعد الطرد المركزي تعليق الخلية في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق، الطامح في supernatant، resuspend الخلايا مع 500 ميكرولترات من الطازجة قبل الدافئة MNC المتوسطة، وإضافة إلى بئر من لوحة 24-جيدا. في اليوم الثاني، استخدم ملليلتر واحد في بئر من 50 ميكروغرام المخفف سابقا لكل ميكرولتر بولي-د-ليسين في D-PBS لمعطف لوحات ستة بئر لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. التعرق بولي-D-يسين من لوحات ستة جيدا, وجافة على مقاعد البدلاء نظيفة عمودي لمدة 10 دقائق.
ثم إضافة ملليلتر واحد في بئر من خمسة ميكروغرام المخفف سابقا لكل مللين إلى لوحات ستة بئر، واحتضان لمدة أربع إلى ست ساعات في 37 درجة مئوية لمعطف. اغسل الأطباق باستخدام D-PBS قبل الاستخدام. في اليوم الثالث، لوحة جميع الشركات متعددة القطاعات التي يسببها فيروس سينداي في الخلايا الجذعية العصبية المستحثة المتوسطة على لوحات بولي-د-ليسين/لامينين المغلفة بستة آبار.
في الأيام الخامسة والسابعة، أضف بلطف ملليلتر واحد من 37 درجة مئوية، و iNSC مُدفأة مسبقًا متوسطة لكل بئر من ألواح الستة آبار. من اليوم التاسع إلى اليوم 28، استبدل الوسيط بـ iNSC المتوسط الطازجة التي تم تسخينها يوميًا. رصد ظهور المستعمرات iNSC، وفي حوالي أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع اختيار المستعمرات مع مورفولوجيا مناسبة باستخدام الماصات الزجاج المحروق ونقل كل مستعمرة إلى بئر منفصلة من لوحة ستة آبار للتوسع.
لإنشاء نماذج الماوس أحادية الجانب 6-hyroxydopamine الآفات، حلق رأس تخدير، الكبار، الذكور، SCID-البيج الماوس، وتطبيق مرهم العين الاريثروميسين. ضع الماوس على جهاز stereotaxic، وإصلاح الماوس مع أشرطة قاطعة. أدخل أكواب الأذن بشكل صحيح لوضع رأس الماوس بشكل آمن ومناسب.
تعقيم الرأس مع اليود povidone والكحول ايزوبروبيل، ومن ثم استخدام شفرة مشرط لجعل شق القوس 1.5 سم تقريبا على جلد الرأس، مما يعرض الجمجمة. اضبط شريط العارضة وقضبان الأذن لتقليل فرق الارتفاع بين البرغما و لامدا إلى أقل من 0.1 ملليمتر. التحرك ببطء وخفض غيض من إبرة microsyringe نحو bregma، والتعامل مع bregma كنقطة الصفر.
نقل طرف إلى موقف مع إحداثيات من الأمامي 0.5 ملليمترات و 2.1 ملليمترات الجانبي نسبة إلى bregma. سحب طرف، وضع علامة على نقطة مع قلم علامة، و، مع الحفر الإلكترونية، قم بحفرة صغيرة في الجمجمة. استخراج اثنين من ميكرولترات من خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر 6-hyroxydopamine حل في microsyringe.
إرجاع الإبرة إلى النقطة ملحوظ، وأدخل الإبرة إلى الظهرية / البطن 3.2 ملليمتر. حقن محلول 6-hyroxydopamine من الحقنة بمعدل ميكرولتر واحد في الدقيقة الواحدة، وترك إبرة الحقن في مكانها لمدة خمس دقائق أخرى، ثم التراجع عنها ببطء. بعد إغلاق شق مع الغرز، وتطبيق مرهم العين الاريثروميسين على العينين مرة أخرى.
إزالة الماوس من جهاز stereotaxic، ووضعها في قفص الانتعاش، والسماح بالوصول إلى الغذاء والماء حتى يستعيد وعيه. بعد أن أصيبت PBMNCs بـ SeV ، كانت مورفولوجياها تتغير وخضعت الخلايا لوفاة شديدة حتى اليوم الخامس. ظهرت مستعمرات INSC في اليوم 12.
بعد التقاط ونقل استنساخ iNSC للتوسع لعدد من المقاطع ، أظهرت مورفولوجيا جيدة ويمكن أن تجدد نفسها بشكل ثابت في وسيط iNSC ، إما في شكل أحادية الطبقة أو ككرينات. بعد 24 يوما من التمايز، تم تحديد iNSCs كالخلايا العصبية الدوبامين كما أعرب عن غالبية منهم التيروزين هيدروكسيلاس، صندوق شوكة A2، والخلايا العصبية الخاصة فئة الثالث علامات بيتا tubulin. بعد إنشاء 6-hyroxydopamine-الآفات الشلل الرعاش المرض الماوس نماذج, وقد أجريت تقييم السلوك لتقدير أعراض مرض باركنسون.
وأظهرت الفئران التي تلقت زرع الخلايا تحسنا كبيرا في وظيفة المحرك. تم التحقق من مدى الآفات الناجمة عن 6-hyroxydopamine عن طريق تلطيخ المناعة بعد الوفاة لTH في المخطط ، حزمة مُنَطِيِة ، وs substantia nigra pars compacta. تم استرداد الإشارات الإيجابية TH بشكل كبير في المخطط حيث تم زرع الخلايا واستعادة أيضا أقل ما يقال في SN. بعد ثلاثة أشهر من زرع, بين الخلايا على قيد الحياة, حوالي 13.84٪ كانت الخلايا العصبية الدوبامين إيجابية TH.
وأعرب حوالي 91.72٪ من الخلايا الإيجابية TH مستقبلات نووية يتيمة، حوالي 86.76٪ وأعرب FOXA2، وحوالي 98.77٪ كانت تحمل علامة تجارية مع G-البروتين إلى الداخل البوتاسيوم المصحح. عند وضع 30 مل من الدم المحيطي المخفف على متوسطة التدرج الكثافة، يرجى القيام بذلك ببطء وبعناية، وليس لإزعاج واجهة التدرج. وينبغي الحرص على تجنب الذوبان والتجميد المتكررين لفيروس سينداي لضمان ارتفاع نشاط الفيروس.
عند إعادة برمجة خلايا الدم أحادية النوى الطرفية إلى الخلايا الجذعية العصبية المستحثة، يرجى الانتباه عن كثب إلى مورفولوجيا الخلايا كل يوم. أيضا، 6-هيدروكسيدوبامين هو الضوء ودرجة الحرارة الحساسة. كن حذرا لحماية الحل من الضوء، والاحتفاظ بها على الجليد قبل الاستخدام.
بعد هذا الإجراء, يمكن للمرء أن يستمر في دراسة آليات المرض باستخدام الخلايا العصبية الدوبامينية المشتقة من المرضى في الثقافة PD الأسرة. يمكن للمرء أيضا أن يستمر في التحقيق في كيفية الخلايا المزروعة تؤثر على الدوائر العصبية التالفة.
