هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح بالتكون من كمية بروتينين في نفس منطقة الدماغ. وهذا يسمح للمجرب للنظر في النشاط في مسارات الإشارات الجزيئية في مناطق الدماغ عن طريق فحص عموم وphosphoproteins. ويمكن أيضا أن تستخدم للتأكد من البروتينات التي هي علامات من الظواهر المعرفية المختلفة.
نحن نستخدم تقنية بسيطة نسبيا، مثل الكيمياء المناعية، للإجابة على الأسئلة التي تتطلب عادة تقنيات أكثر انخراطا. بما في ذلك فحص نشاط مسارات الإشارات الجزيئية ، وفحص نسبة AMPA / NMDA. باستخدام التبريد التي حافظت بين ناقص 9 درجات مئوية وناقص 12 درجة مئوية، شريحة الدماغ الفئران المعزولة والمجمدة سابقا في المناطق ذات الاهتمام في 30-50 ميكرومتر.
مباشرة جبل شرائح على الشرائح الزجاجية وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية حتى الكيمياء المناعية. إزالة الشرائح الزجاجية من الثلاجة والسماح لهم لتكساء درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. العمل تحت غطاء محرك الدخان، ووضع الشرائح في 4٪ paraformaldehyde في 0.1 PBS المول لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الأنسجة.
ثم شطف الشرائح في 0.1 سلس الضرس ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل من. لـ permeabilize أغشية الخلايا، احتضان الشرائح في المنظفات خفيفة لمدة 30-60 دقيقة. وشطف مرة أخرى في TBS ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل من.
تخفيف الجسم المضاد الأولي للبروتين الذي يثير الاهتمام في PBS في التركيز الصحيح كما هو موضح في المخطوطة. محلول الأجسام المضادة الأولية من الماصات مباشرة على أنسجة المخ. ضع غطاءً ينزلق على الشرائح واحتضان أنسجة المخ في تخفيف الأجسام المضادة الأولية لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
بعد الاحتضان، قم بإزالة زلات الغطاء وغسل الشرائح في TBS التي تحتوي على كمية صغيرة من المنظفات المضافة إليها، أربع مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في خفف يحتوي على TBS، والمنظفات، و 1.5٪ من مصل المضيف. إضافة الأجسام المضادة الثانوية إلى الشرائح، وتغطية مع زلات الغطاء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
بعد الحضانة، شطف الشرائح في TBS-T أربع مرات لمدة 20 دقيقة لكل من ثم في TBS أربع مرات لمدة 20 دقيقة لكل من. جفف الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام، بين عشية وضحاها. ضع الشرائح على واجهة المسح القريبة من الأشعة تحت الحمراء مع مواجهة الأنسجة لأسفل.
صورة شرائح متعددة في كل مرة باستخدام أداة التحديد. صور الشرائح باستخدام إعداد أعلى مستويات الجودة بدقة 21 ميكرومتر. في تعويض من نانومتر صفر، استيراد الصور في برنامج تحليل الصور لعرض ووضع علامة لتحليل البروتين semiquantitative.
بعد فتح برنامج تحليل الصور، حدد منطقة العمل التي تم مسح الصورة فيها ضوئيًا. ثم افتح الصورة الممسوحة ضوئيًا في برنامج تحليل الصور لعرض المسح الضوئي وضبط الأطوال الموجية والتباين والسطوع والتكبير المعروضة دون تغيير الصورة الخام أو إجمالي الانبعاثات الكمية. بعد تحديد المناطق الرئيسية لتحديد كمي، حدد علامة التبويب التحليل على طول الجزء العلوي من الصفحة، ثم حدد رسم المستطيل لرسم مستطيل على المنطقة التي سيتم تحديدها كميا.
لعرض حجم المستطيل، حدد الأشكال الموجودة على الجانب السفلي الأيسر من الشاشة. ثم حدد الأعمدة على طول أسفل اليمين. ثم إضافة أعمدة الارتفاع والعرض لتحديد حجم الشكل.
وأخيراً، قم بتسمية الشكل وكرر. بمجرد أخذ عينات من كافة المناطق، تابع عملية دمج البيانات المتوفرة من علامة تبويب الأعمدة وتحليلها. للتحقق من أن هذا البروتوكول يعمل، تم احتضان أقسام الدماغ مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية، والأجسام المضادة الثانوية وحدها، أو لا الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية.
تم الكشف عن التعبير الجيني المبكر المباشر c-Jun في الحصين الظهري والأميغدالا فقط عندما تم تطبيق الأجسام المضادة الأولية والثانوية على أنسجة الدماغ. GluR1 وحدة فرعية من مستقبلات AMPA ووحدة فرعية NR2A من مستقبلات NMDA تم فحصها في الكشف عن بروتين البراز في نوى اللوزة. سمح هذا بفحص نسبة مستقبلات NMDA AMPA في النوى الفرعية لللوزة التي هي توقيع عصبي للتعلم والذاكرة.
تم الحصول على القياسات المتوسط وتطبيع التعبير البروتيني من مسح عالي الدقة في قرن آمون البطني. باستخدام برنامج تحليل الصور ، يتم وضع مستطيل في المنطقة ذات الاهتمام ، وتم استخدام متوسط كثافة الضوء من الشكل كمقياس للتعبير الفلوروفور ، وهو مقياس للتعبير عن البروتين. للحصول على المنحنى المُطَيَّر، تم وضع شكل عبر منطقة تعبر عن إشارة عالية وكانت الإشارة المنخفضة في المنطقة تحت المنحنى تستخدم كمقياس للتعبير البروتيني.
أكبر صراع مع هذا الإجراء هو العثور على جسم مضاد والتأكد من أنه يعمل. التطبيق بسيط. نصيحتي ستكون أولا محاولة إجراء مناعة مناعة منتظمة ، ثم حاول هذه التقنية.
إجراء فحص التحقق من الصحة أولاً. أهم شيء يجب تذكره هو التحقق من تخفيف الجسم المضاد والتأكد من تطبيقه بشكل صحيح. بدون هذه الخطوات، ستفشل الإجراء.
