والسؤال الرئيسي الذي نريد أن نعالجه بهذه الطريقة هو كيف يمكننا استخدام عينات الحمض النووي الريبي من المواد المشتراة في أسواق الأغذية المحلية لاستنساخ الجينات ذات الصلة بالتكنولوجيا الحيوية؟ هنا، نستخدم محار المحيط الهادئ كدراسة حالة للتدليل على هذا النهج وإمكانية تطبيق المزيد. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن التحايل على تسلسل الجينوم التقليدي أو تسلسل عينات المحار.
وبدلاً من ذلك، تمت مقارنة تسلسلات الوحدة الفرعية 1 وDH dehydrogenase السيتوكروم c مع التسلسلات المرجعية المتاحة للجمهور من محار المحيط الهادئ لاختيار العينة الأكثر ارتباطاً. ويمكن استخدام الحمض النووي المأخوذ من هذه العينة مباشرة لاستنساخ الجينات ذات الصلة بالتكنولوجيا الحيوية، التي يمكن اختيارها باستخدام معلومات التسلسل العام. ومن خلال هذا الاجراء سيكون يونغمى ليو ويوكوان لى وهما طالبان خريجان من مركز جليكوميكس وجليكان للهندسة الحيوية بجامعة نانجينغ الزراعية .
لإعداد عينة أنسجة المحار، استخدم مشرط معقمة لقطع ما يقرب من 100 ملليغرام من الأنسجة الرخوة المتجانسة من المركز الهندسي التقريبي لكل عينة المحار. نقل العينة إلى هاون مملوءة 50 ملليلتر من النيتروجين السائل. طحن نسيج المحار فلاش المجمدة في مسحوق ناعم.
تزن من أصل 75 ملليغرام من الأنسجة المجمدة كل عينة في أنبوب جهاز طرد مركزي معقمة 1.5 ملليلتر، ومزيج مع ملليلتر واحد من الكواشف استخراج thiocyanate-الفينول guanidinium. الخطوة الأكثر أهمية من هذا الإجراء هي خطوة استخراج الحمض النووي الريبي. من أجل تقليل تحلل الحمض النووي الريبي، من الضروري تقليل الوقت بين حصاد أنسجة المحار واستخراج الحمض النووي الريبي.
جهاز طرد مركزي العينة في 14،000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. نقل المابير إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر الطرد المركزي، إضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم، وتخلط جيدا على خلاط دوامة لمدة 10 إلى 15 ثانية حتى يتحول الخليط أبيض حليبي. بعد ذلك، الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة كما كان عليه سابقا.
مع ماصة 200 ميكرولتر، نقل بعناية الطبقة مائي العليا، دون إزعاج بينphase، إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر الطرد المركزي. إضافة 500 ميكرولترات من الكحول ايزوبروبيل في أنبوب الطرد المركزي، وعكس بلطف لخلط العينات. ثم اترك العينات على الجليد لمدة 20 دقيقة.
جهاز طرد مركزي في 14،000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة ثماني دقائق، وإزالة فائقة. إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من 75٪ الإيثانول، والطرد المركزي في 14، 000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. إزالة كل من افرات، وتكرار غسل في الإيثانول.
جفف الكريات لمدة ست دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، قم بحل بيليه الحمض النووي الريبي المجفف في 25 ميكرولترات من المياه المعالجة DEPC، والحفاظ على أنبوب على الجليد. استخدم عينات الحمض النووي الريبي في غضون 24 ساعة.
لتوليد مكتبة cDNA، أولاً إعداد خليط تفاعل لكل عينة RNA في أنبوب PCR 300 ميكرولتر عن طريق إضافة حلول وفقا للمخطوطة. إضافة ميكرولتر واحد من عينة الحمض النووي الريبي المستخرجة في الأنبوب. احتضان الخليط في ثيركلوسير PCR لمدة 60 دقيقة في 42 درجة مئوية، ومن ثم زيادة درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
تخزين مكتبة cDNA ولدت لمدة تصل إلى 12 شهرا في ناقص 20 درجة مئوية. أولاً، إضافة ميكرولتر واحد من مكتبة cDNA التي تم إنشاؤها إلى أنابيب تحتوي على مخاليط البوليسول الخماسي الكلور، التي أعدت وفقا للمخطوطة. ضع أنابيب PCR في الدراجات الحرارية PCR، وتنفيذ تضخيم PCR مع خطوة التكرار الأولية و 35 دورة تفاعل PCR تتكون من خطوة التلوي، خطوة التهطال، وخطوة التكهّن وفقا للمخطوطة.
بعد الدورات، قم بتنفيذ خطوة الاستطالة النهائية لمدة خمس دقائق. استخدام خمسة ميكرولترات من المنتج PCR للتحقق من الجودة بواسطة agarose هلام electrophoresis. مراقبة تضخيم الجين COX1 أو ND كزراعة واحدة في إما 759 أو 748 قاعدة أزواج، على التوالي.
لتنقية بقية المنتج PCR، إضافة 100 ميكرولترات من الحمض النووي ملزم العازلة التي تحتوي على تركيزات عالية من الأملاح chaotropic لكل عينة. دوامة لفترة وجيزة لخلط المحتويات. ضع عمود تنقية في أنبوب جهاز طرد مركزي ميليلتر اثنين.
الماصات خليط التفاعل في العمود. ضع الأنبوب مع العمود المثبت في جهاز طرد مركزي عند 14000 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. بعد التخلص من الترشيح من أنبوب الطرد المركزي ميليلتر اثنين، وغسل مرتين مع 700 و 400 ميكرولترات من محلول الغسيل W2 عن طريق الطرد المركزي في 14، 000 مرات ز.
بعد ذلك ، سخني ميليلتر واحد من الماء الأيوني إلى 65 درجة مئوية في سخان كتلة معدنية. نقل العمود إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر الطرد المركزي، والماصات 25 ميكرولترات من المياه المنزوعة المُحمّى إلى مركز غشاء العمود الأبيض. دع الغشاء ينقع لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ثم، الطرد المركزي أنبوب مع العمود في 14، 000 مرات ز لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل العمود، وتخزين المنتج PCR المنقى لمدة تصل إلى 12 شهرا في ناقص 20 درجة مئوية. اختيارياً، يمكن أيضاً استخدام ال التمهيديات العكسية COX1 أو ND لتسلسل ثنائي الاتجاه.
بالنسبة لتسلسل Sanger، استخدم التمهيدي ND أو ND ذي الصلة. بعد استرجاع نتائج التسلسل، قارن التسلسلات مع تسلسل الجينوم من سلالة مرجعية المحار المحيط الهادئ باستخدام أداة NCBI Nucleotide BLAST على الإنترنت. استخدام كل من ال التمهيديات إلى الأمام وعكس من الجينات MgUGD وميغ UXS لتضخيم وتنقية عن طريق PCR كما فعلت سابقا.
بعد احتضان منتجات PCR المنقية مع عازلة الهضم، وإعداد ناقلات pET-30a قبل هضم عن طريق حل 500 نانوغرام من pET-30a في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر، وإضافة المياه deionized إلى أعلى تصل إلى 16 ميكرولتر. ثم، إضافة اثنين microliters من 10 مرات مركزة هضم العازلة وmicroliter واحد كل من 20 وحدة تقييد endonucleases Nde1 وXho1 في الأنبوب. احتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.
بعد ذلك، إضافة ميكرولتر واحد من وحدة واحدة فوسباتيز القلوية، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة إضافية. ثم، ضع الأنبوب في سخان كتلة معدنية محمّاة مسبقاً عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإلغاء تنشيط فوسفاتاز القلوية. بعد زراعة خلايا E.coli BL21 التي تحمل جينات MgUGD و MgUXS ، قم بنقل الثقافة إلى متوسط LB 400 ملليلتر في قارورة تهتز سعة لترين ، ووضعها على شاكر عند 200 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
بعد ثلاث ساعات، تحقق من الكثافة البصرية على مقياس ضوئي عند طول موجة 600 نانومتر، وتأكد من وصولها إلى امتصاص حوالي 0.5. ثم خفض درجة حرارة شاكر إلى 20 درجة مئوية. إضافة 400 ميكرولترات من IPTG مولور واحد للحث على التعبير عن البروتينات المؤتلفة لمدة ثلاث ساعات.
بعد حصاد الخلايا، وتعطيل الخلايا عن طريق سونيكيشن لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 14،000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة، وجمع المابير في أنبوب جديد لاختبار النشاط. بعد فحص النشاط، أطفئ التفاعلات بإضافة 20 ميكرولترات من الميثانول و40 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى مصبغة MgUXS وملغوغد.
دوامة خليط العينة، والطرد المركزي في 14،000 مرات ز لمدة ست دقائق وأربع درجات مئوية. جمع الطبقة مائي العلوي من كل أنبوب في أنابيب جديدة لقياس الطيف MALDI-TOF الشامل. في هذه التجربة، تمت مقارنة محاذاة تسلسل تسلسل التسلسل من التسلسلات الجينية COX1 و ND من عينة شديدة التباين مع سلالة المحار المحيط الهادئ المرجعية.
وتبين الأسهم الحمراء اختلافات النيوكليوتيدات بين التسلسل المرجعي وتسلسل عينات الحمض النووي المأخوذة. تسلسل جينات COX1 وND لعينة المحار ذات الصلة وثيقة تظهر اختلاف منخفض عن سلالة المحار المحيط الهادئ المرجعية. MALDI-TOF الطيفي الشامل يظهر التطبيق الناجح لمكتبة cDNA لاستنساخ الجينات ذات الصلة صناعيا MgUGD و MgUXS.
كما تحدد صورة الجل حمض UDP-glucuronic و UDP-xylose الناتج عن العمل الأنزيمي للمغوج والملغوكسيسيوم المعبّر عنه على نحو متتابع ومنقى. ولا تتطلب هذه الطريقة تطابقاً كاملاً بين التسلسل المرجعي وتسلسل العلامات الذي تم الحصول عليه، وينبغي أن تمنح الباحث الثقة للعمل مع المحار غير المتحقق. ويمكن، من حيث المبدأ، تطبيق هذه الطريقة على أي عينة بيولوجية غير مُستَدَرة تكون فيها التسلسلات المأخوذة من أنواع مرجعية وثيقة الصلة متاحة للجمهور.
وتسمح هذه الطريقة للباحثين غير الخبراء بالوصول بسهولة إلى المواد الوراثية ذات الأهمية البيولوجية المحتملة، وتمهد الطريق أمام المزيد من العلماء للعمل مع عينات بيولوجية يسهل الوصول إليها ولكنها غير محددة بعد.
