وتقييم المشاركة المستهدفة، أي تفاعل المخدرات مع البروتين الذي صمم من أجله، هو شرط أساسي لتفسير النشاط البيولوجي لأي مركب في تطوير العقاقير، أو في مشاريع البحوث الأساسية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقياس تأثير الجرعة وديناميات الاشتباك المستهدف لـ KDM1A، بدلاً من قياسات تأثيرات المصب مثل علامات الهستون والتعبير. ويمكن تطبيق هذه التقنية في البحوث الأساسية وأيضا في التجارب السريرية، في الجهاز العصبي المركزي أو أمراض أخرى تخضع للعلاج مع مثبطات KDM1A لدراسة ديناميكا دوائية.
ويستند هذا الأسلوب على العلاج الكيميائي وضعت لدراسة ORY-1001، iadademstat، ولكن يمكن استخدامها حقا لمثبطات KDM1A أخرى واستراتيجية يمكن تطبيقها على أهداف أخرى. سيتم إثبات الإجراء من قبل راكيل رويز، مدير العمليات في منصة اكتشاف PK/PD من مختبري. أثناء معالجة الخلية مع ORY-1001 يرتبط المركب إلى البروتين KDM1A الموجودة في النواة.
لبدء هذا الإجراء، واسترداد 10 ميكرولتر واحد use aliquot من 20 ملليمترا biotinylated مسبار OG-881 حل المخزون من الثلاجة والسماح لها الاحماء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. باستخدام micropipet مع نصائح التصفية، بشكل متسلسل تخفيف حل الأسهم لإعداد حل العمل micromolar اثنين. بعد ذلك ، قم بحل قرص واحد من مثبطات البروتياز في ملليلتر واحد من PBS في أنبوب microcentrifuge.
لكل ملليلتر من حجم المطلوب من 1x خلية تحلل العازلة مع العلاج الكيميائي، مزيج 100 ميكرولترات من التجارية التي تم الحصول عليها 10x خلية تحلل العازلة، 150 ميكرولترات من مثبطات البروتياز 10x، 12.5 ميكرولترات من اثنين من الحل العامل OG-881 micromolar و 737.5 ميكرولترات من نوع-1 مزدوجة الماء المقطر. يتم تحلل الخلايا في 1x تحلل العازلة في وجود الكيماوي الذي يربط مع أي بروتين KDM1A مجانا. للتحضير من الأنسجة ، استخدم هاون وحشرات مبردة على الجليد الجاف لسحق وتجانس قطعة سنتيمتر مكعب واحد من الأنسجة المجمدة.
Aliquot الأنسجة في قارورة ذات استخدام واحد، مع التأكد من نقل ما يقرب من 40 ملليغرام من مسحوق الأنسجة في كل قارورة، مع تجنب الذوبان في جميع الأوقات. تخزين العينات في 80 درجة مئوية حتى جاهزة للمعالجة. لإعداد من الكريات الخلية، resuspend بيليه من حوالي 10 مليون خلية في 200 ميكرولترات من تحلل الخلايا 1x العازلة التي تحتوي على 25 نانوموللار OG-881.
دوامة كل عينة لفترة وجيزة والاحتفاظ بها على الجليد لمدة خمس دقائق. باستخدام سونيكاتator، sonicate العينات مع ثلاث نبضات في 45 كيلو هيرتز دائم لمدة 20 ثانية لكل من. ضع العينات على الجليد لمدة 20 ثانية بين البقول.
إبقاء العينات على الجليد لمدة خمس دقائق إضافية. ثم، دوامة لفترة وجيزة والطرد المركزي العينات في 14،000 مرات G لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي الذي هو ما قبل المبردة في أربع درجات مئوية. باستخدام ميكروبيبت ميليلتر واحد نقل كل عظمى في أنبوب منفصل 1.5 ملليلتر microcentrifuge.
اترك الأنابيب على الجليد لمدة ساعتين قبل المعالجة. ثم، كمي البروتين الأصلي باستخدام مقايسة برادفورد كما هو موضح في بروتوكول النص. لوحة إجمالية مغلفة بالأجسام المضادة KDM1A.
لوحة مجانية مغلفة مع streptavidin. ثم يضاف lysate الخلية إلى كل من لوحات ويتم التقاط مجمع KDM1A مباشرة أو من خلال العلاج الكيميائي. يتم غسلها لوحات ومحتضنة مع المضادة المضادة KDM1A المضادة المضادة والجسم المضاد الثانوية مقترنة بيروكسيديز الفجل.
وأخيرا، يتم إضافة الركيزة الإنارة وإشارة ولدت. بالنسبة لمجموع KDM1A ELISA، قم بإعداد 10 ملليلترات من الأجسام المضادة KDM1A في برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من اثنين ميكروغرام لكل ملليلتر لكل لوحة. نقل 100 ميكروليتر في كل بئر من لوحة.
لKDM1A ELISA مجانا، وإعداد 10 ملليلتر من streptavidin في برنامج تلفزيوني كتركيز 10 ميكروغرام لكل ملليلتر لكل لوحة. نقل 100 ميكروليتر في كل بئر من لوحة. ثم، ختم أعلى كل لوحة مع فيلم لاصق واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي، قم بإزالة الأطباق من الثلاجة واتركها توازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة تقريبًا. اغسل كل طبق ثلاث مرات مع عازلة الغسيل، مع التأكد من الاستفادة من لوحة على المناشف الورقية بعد كل خطوة الغسيل لإزالة أي حل المتبقية. إضافة 200 ميكروليتر من العازلة حظر إلى كل بئر من كل من لوحات.
أعلى ختم لوحات مع فيلم لاصق واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. وفي الوقت نفسه، تمييع مستخلصات البروتين الأصلي التي تم الحصول عليها سابقا مع برنامج تلفزيوني إلى التركيز المناسب ووضع لوحة لإعداد منحنى قياسي باستخدام الإنسان rKDM1A كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد اكتمال الحضانة لمدة ساعتين، تخلص من عازلة الحجب وغسل الأطباق مع عازلة غسل، مع التأكد من الاستفادة من لوحة على المناشف الورقية بعد كل خطوة الغسيل لإزالة أي حل المتبقية.
نقل العينات المخففة المناسبة إلى كتلة تخزين آبار عميقة 96 المبردة بعد توزيع اللوحة الموجودة في الجدول الثاني من بروتوكول النص. الحفاظ على هذه الكتلة على الجليد في حين pipetting 100 ميكروليتر في البئر في لوحات ELISA المجموع والحرة بعد توزيع لوحة وجدت في الجدول الثالث من بروتوكول النص. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، ثم تجاهل العينات وغسل لوحات خمس مرات مع عازلة الغسيل.
إعداد 20 ملليلتر من الأرانب المضادة KDM1A المضادة للكشف في كتلة العازلة في تركيز 0.125 ميكروغرام لكل ملليلتر. إضافة 100 ميكرولترات من كشف حل الأجسام المضادة إلى كل بئر من كلا الصفائح، باستثناء تلك المقابلة للضوابط السلبية. أعلى ختم لوحات مع فيلم لاصقة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك، تجاهل حل الأجسام المضادة للكشف وغسل لوحات ست مرات مع العازلة غسل. إعداد 25 ملليلتر من الأجسام المضادة المضادة الماعز الثانوية المضادة للأرانب، HRP، إلى تخفيف من واحد إلى 5،000 في عازلة منع. إضافة 100 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر من لوحات microtiter واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
قبل 30 دقيقة من نهاية هذا الحضانة، مزيج أجزاء متساوية من محسن لومينول ومحلول بيروكسيد في زجاجة العنبر في ظل ظروف خفيفة لينة. اترك هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة. عندما اكتمال الحضانة ساعة واحدة، والتخلص من حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل لوحات ست مرات مع عازلة غسل.
المقبل، pipet 100 ميكرولترات من حل العمل لومينول إلى كل بئر من لوحات، والتأكد من pipet ببطء شديد لتجنب تشكيل فقاعة. استخدام جهاز توقيت للسيطرة على الوقت بين إضافة الحل وقياس الإنارة من لوحات والحفاظ على هذا الوقت ثابت لتحقيق جيدة بين التكرار. قم بختم اللوحات بالأفلام اللاصقة وأجهزة الطرد المركزي بمعدل 500 مرة في G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 45 ثانية للقضاء على أي فقاعات متبقية.
احتضان لوحات على لوحة شاكر في 100 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. ثم، إزالة فيلم لاصقة وإدراج لوحة في قارئ microplate وتركها لمدة ثلاث دقائق لتحقيق الاستقرار في درجة الحرارة عند 25 درجة مئوية. اقرأ وحدات الإنارة النسبية لكل مقايسة لوحة ELISA.
حفظ القيم RAW RLU ونسخها من ملفات جدول البيانات الخام لمزيد من التحليل. في هذه الدراسة، يتم استخدام رواية KDM1A التقاط الكيماوي ELISA مقرها لقياس مباشرة KDM1A الاشتباك المستهدف في الخلايا وعينات الأنسجة. يتم تقييم قيم RLU من إجمالي و rKDM1A حرة للتحقق من الخطية.
ثم يتم فرض قيم RLU من KDM1A المجموع والحرة التي تم الكشف عنها في PBMCs الإنسان من ثلاثة متطوعين مستقلين على المنحنى القياسي. يتم استزراع خلايا AML بعد توصيات الموفر ويتم التعامل معها إما بمركبة أو ORY-1001 بتركيزات مختلفة. يتم الحصول على استخراج البروتين الأصلي في وجود 25 ملليمتر OG-881 chemoprobe ويستخدم 0.5 ميكروغرام من البروتين الكلي لإجراء تحليل المشاركة المستهدفة.
يتم بعد ذلك تحديد إجمالي وخالى KDM1A ويتم حساب النسب المئوية للمشاركة المستهدفة من ORY-1001 إلى KDM1A نسبة إلى السيارة. الجرعة المستجيبة KDM1A الهدف المشاركة في PBMCs وفي علاج الرئة من الفئران مع ORY-1001 عن طريق gavage عن طريق الفم، والنسبية المحسوبة مجموعة السيارة هو مبين هنا. الحضانة السابقين مع الحاضنة nanomolar ORY-1001 من مستخلصات البروتين الرئوي من الحيوانات المعالجة مركبة، وغلة TE كامل، ولكن لا زيادة في TE في عينات من الفئران المعالجة لمدة أربعة أيام مع 30 ميكروغرام لكل كيلوغرام ORY-1001، مؤكدا KDM1A بالفعل تماما في الجسم الحي.
ويقيِّم هذا البروتوكول الالتزام المستهدف من قِبل KDM1A من خلال قياس الهدف الحر والمجموعي لـ KDM1A. تذكر أنه يتطلب استخراج البروتين الأصلي. ويمكن استخدام هذه التقنية على عينات من أنواع مختلفة لتقييم مثبطات محددة، وأيضا لفحص مثبطات جديدة.
ويمكن أيضا أن يكون تطبيق العلاج الكيميائي المستخدمة في هذه الدراسة للمعالجة الكيميائية للمعالجة التفاعل KDM1A. تذكر أن تعمل بأمان وتحترم في جميع الأوقات التدابير الوقائية عند التعامل مع العينات البيولوجية والمركبات النشطة بيولوجيا مثل مثبطات KDM1A.
