ويسمح هذا البروتوكول برص شدة انكماش البلاستوسوست وإعادة التوسع خلال تدخلات التزجيج السابقة والاسترداد بعد الاحترار، ويوفر رؤى حول فعالية أساليب تزجيج الفيروسات. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها على مختبرات الإخصاب في المختبرات المجهزة بمجاهر زمنية وأجهزة كمبيوتر مزودة ببرامج متقدمة لتحرير الصور. في اليوم الخامس أو السادس من التوسع ، يخضع لـ blastocyst مع عدد قليل من الخلايا الجماعية الداخلية على الأقل وtrophectoderm متماسك إلى نبض ليزر 0.4 إلى 0.7 مللي ثانية مع قطر ثقب يتراوح بين 4.3 إلى 9.4 ميكرومتر موجه بشكل عرضي إلى zona pellucida وتقاطع خليتين trophectodermal المجاورتين.
ثم، السماح للبلاستوكويل إلى انهيار كليا أو جزئيا لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، استخدم ماصة صغيرة لإضافة وسيط توازن بشكل مُسعد إلى ثقوب منطقة microdroplet لطبق بتري من تسعة بئر ، مصمم خصيصًا للمجهر والتسجيل. عندما تم إضافة كل من المتوسطة، تراكب المنطقة microdroplet مع ما يقرب من 30 ميكرولترات من وسيط التوازن.
وغمر الكيسة البلاستوسيست المعالجة بالليزر في وسيط التوازن في الجزء السفلي من بئر ميكرودروليه واحد من طبق microdroplet. بمجرد نقل الكيسة، بدء مؤقت العد التنازلي لمدة 10 دقائق. ونقل طبق microdroplet على خشبة المسرح من المجهر مجهزة بالكاميرا.
باستخدام التكبير 200 X، ضبط طبق microdroplet بحيث يتم وضع الكيسة في مركز تقريبا من نافذة التسجيل. ثم، بدء التسجيل مع برنامج تسجيل المجهر مشيرا إلى وقت العد التنازلي الذي يتم بدء التسجيل. لتخزين الكيسة، بعد تحميل الجنين في قش التعبئة، ختم القش، وتغرق القشة في النيتروجين السائل بين 80 إلى 110 ثانية من التحميل، قبل وضع الكيسة الأردية في درجة حرارة سالبة 196 درجة مئوية.
لقياس المنطقة المقطعية من blastocyst رصد خلال مرحلة التوازن ، وضع علامة أداة الاختيار السريع داخل blastocyst حتى اللمس على حافة الكيسة الفسيفوسيست وانقر مرارا وتكرارا على زر الماوس الأيسر لتحديد الحافة الخارجية للبلاستوسيست حتى تم اختيار كامل منطقة المقطع العرضي من blastocyst. ثم، في نافذة المخطط الزمني، انقر فوق سجل القياس وقياسات السجل. لإعادة توسيع الكيس، بسرعة نقل القش HSV مع blastocyst vitrified من التخزين إلى خزان محمول السائل مملوءة بالنيتروجين.
واستخدام ملقط لرفع القشة فقط عالية بما يكفي لفضح قضيب المناولة الملونة. استخدام متجرد الأسلاك الذاتي ضبط لخفض القش في ذروة قضيب المناولة الملونة. واستخراج قضيب المناولة من القش بحركة سريعة تسيطر عليها.
يغرق على الفور ملعقة منحنية من قضيب المناولة في حاوية من 37 درجة مئوية حل ذوبان الجليد. ودوامة بلطف قضيب المناولة لفصل الكيسة. بعد دقيقة واحدة، وغسل الكيسة مع الغمر المتتابعة أربع دقائق ومحلول التخفيف.
غسل الحل واحد، وغسل الحل الثاني. بعد ذلك، نقل الكيسة الدافئة في طبق أربعة بئر يحتوي على متوسط الانتعاش الطازجة واستخدام ماصة لغسل الكيسة في جميع قطرات ثلاث من المتوسطة. بعد الغسيل الأخير، نقل الكيسة إلى تسعة صحن مرور الوقت جيدا، تحتوي على متوسط الانتعاش.
ووضع طبق الآبار التسعة تحت كاميرا الفاصل الزمني في حاضنة 37 درجة مئوية، و6٪ ثاني أكسيد الكربون و5٪ O2. الآن، افتح برنامج تسجيل الفاصل الزمني وحدد كاميرا تسجيل. حدد الوضع المباشر ووضع المؤشر على الصورة.
قم بالتمرير لتكبير الصورة واستخدام زر الماوس الأيسر لوضع البئر الذي يحتوي على الكيسة في منتصف الشاشة. تحت التركيز ، واستخدام الأسهم لتركيز تسجيل الطائرة من blastocyst وتحت شدة الضوء تعيين شدة الضوء من الصورة. انقر فوق معلمات المجهر لتعيين وقت التعرض وغاما، وانقر فوق إغلاق الوضع المباشر.
انقر فوق بدء المشروع لإدخال بيانات المشروع. حدد نوع طبق الثقافة وقم بإلغاء تحديد كافة المواقف باستثناء تلك التي سيتم تسجيلها. ثم، تعيين توقيت التقاط لالتقاط صورة كل خمس دقائق وانقر فوق الموافقة لتسجيل توسيع blastocyst لمدة 150 دقيقة على الأقل.
في هذا الممثل، ورصدها باستمرار، الجنين سليمة، لم ينحل تماما في حل التوازن و إعادة توسيع إلى حوالي 70٪ من الحجم الأصلي، بعد 10 دقيقة من التعرض لمحلول التوازن. وعلى النقيض من ذلك، تم إفراغ هذا الكيس البلاستوسيست المنهار بشكل مصطنع بالكامل من المكوّن الفموي مباشرة بعد المعالجة بالليزر، ولم يلاحظ أي إعادة توسعة كبيرة خلال الدقائق العشر من التعرض لمحلول التوازن. عند العلاج مع متوسطة التبخير ، التي تحتوي على تركيز عال من مواد التبريد ، خضع هذا البلاستوسيست المُحَسَن لهذا الحد من البلاستوكويل.
بعد الاحترار، فإنه إعادة توسيع مرة أخرى عند التعرض لوسيلة الانتعاش. هذا الليزر نبض blastocyst ومع ذلك، أظهرت انهيار فوري من blastocoel على العلاج مع الليزر، التي لم يتم استردادها خلال خطوات التوازن أو vitrification، مما يشكك في ضرورة مثل هذه المرحلة توازن طويلة لبلاستوسيستات المنهارة. كما يعطي البروتوكول نظرة ثاقبة على قدرة الكيسات البلاستوسيت على استعادة المكورات الأنفية بعد الاحترار.
على سبيل المثال، يمكن أن يكون الإندباس من إعادة التوسع بعد الاحترار خطياً، أو يمكن أن يقاطع بعدة تقلصات أكبر أو أصغر. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر أن الأجنة يجب أن تبقى في الجزء السفلي من طبق بتري أثناء التسجيل ، أقل وقت ممكن. لا تنس أن التركيزات العالية من المواد المبردة يمكن أن تكون سامة للأجنة.
بعد كل تطور، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا المبردة، لاستكشاف فعالية بروتوكولات الحفظ بالتبريد في برنامج الإخصاب في المختبر.
