يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تقييم آثار الأدوية العلاجية في مجال بطانة الرحم ، مثل آثار المركبات المضادة للاندروجيني على حجم الآفات بطانة الرحم. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقييم آثار الأدوية المحددة في النماذج الحيوانية لبُلُق الرحم في الوقت الحقيقي، وليس في نقطة النهاية. وسوف يكون إثبات الإجراء جيسيكا مارتينيز، وهو فني من مختبري، وكذلك فيفيانا بيسبال ونيري مارين، وهما طبيبان بيطريان من مركز الاستثمار برينسيبي فيليبي والذين هم متعاونون بشكل وثيق مع فريقنا.
قبل يومين إلى ثلاثة أيام من جراحة الزرع، نقل شطف، صحية شظايا خزعة الأنسجة بطانة الرحم في طبق بيتري 10 سم تحتوي على متوسط كامل، واستخدام مشرط لفرم الأنسجة إلى قطع مكعبة من خمسة إلى 10 ملليمترات. باستخدام micropipette، إضافة 30 إلى 50 قطرات ميكرولتر من DMEM عبر الجزء السفلي من طبق ثقافة جديد 10 سنتيمترات، وترك مساحة كافية بين كل قطرة بحيث لا تأتي في اتصال مع بعضها البعض. عندما تم وضع كل من قطرات، واستخدام إبرة حقنة لوضع قطعة واحدة من شظايا النسيج الخزعة في كل قطرة.
بعد ذلك ، أضف 100 إلى 200 ميكرولترات من adeno-mCherry المعدة حديثًا إلى بئر واحد من 96 بئرًا لكل جزء من الأنسجة ، بالإضافة إلى ثلاثة آبار مع DMEM خالية من الفيروس الغدي كتحكم سلبي. ثم استخدم الإبرة لنقل عينة واحدة من الأنسجة إلى كل بئر من محلول adeno-mCherry لاحتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي وضع لوحة على مرحلة المجهر fluorescence واستخدام الليزر 568 نانومتر للتحقق من شظايا لوضع العلامات الأمثل.
استخدام التخفيف المناسب من إصابة فيروس الغدة الأدينوية mCherry هو المفتاح لوضع العلامات الفعالة للأنسجة. حتى لتحديد التركيز المناسب، عدة لتخفيف mCherry، لكل تجربة على حدة، يجب أن يتم تقييمها. ثم نقل شظايا الأكثر تألقا في آبار فردية من لوحة جديدة 96 بئر تحتوي على الطازجة، والمتوسطة كاملة.
بعد سبعة أيام على الأقل من استئصال المبيض ، قم باستئصال شظايا الأنسجة بطانة الرحم في طبق بيتري ، وتأكيد عدم الاستجابة لقرصة إصبع في مُجَدَّد ومُجَنَّد. مع الماوس في موقف سوبين تطهير منطقة البطن وجعل شق طولي 1.5 سنتيمتر في البطن. فصل الجلد من العضلات وجعل 1.5 سنتيمتر ثانية شق في العضلات للوصول إلى تجويف البريتوني.
عقد على الحافة اليسرى من جدار البطن العضلي مع مصغرة ملقط، أضعاف العضلات لفضح الوجه الداخلي من الصفاق على السطح الخارجي للحيوان. استخدام ملاقط صغيرة لنقع لفترة وجيزة زرع بطانة الرحم في ن-بوتيل استر سيانوكريلات لاصقة وإرفاق جزء إلى البريتونيوم. عندما يتم تجفيف لاصقة، ووضع زرع الثانية على الجانب contralateral من الصفاق كما أظهرت للتو.
استخدام خياطة امتصاص 6-0 لإغلاق طبقة العضلات وغير قابلة للامتصاص 6-0 خياطة لإغلاق الجلد. ثم تنظيف شق الجلد مع محلول مطهر ووضع الحيوان في منطقة الانتعاش مع مراقبة حتى إعادة شغل كامل. للتصوير الفلوري في vivo من شظايا الأنسجة المزروعة، 24 إلى 48 ساعة بعد جراحة الزرع بدوره على نظام التصوير في vivo، وتهيئة البرنامج، والسماح للكاميرا CCD لتهدئة لبضع دقائق.
مرة واحدة الصك هو مكان جاهز الفأر تخدير أول في قفص نظام التصوير في vivo، في موقف سوبين، مع الرأس داخل أنبوب متصل آلة التخدير، وإغلاق الغطاء. ثم انقر فوق الحصول على وحفظ الصور الناتجة الخمسة. لتحديد كمية في vivo fluorescence ، في برنامج تحليل الصور المناسبة انقر فوق تصفح وحدد الملف غير المُزَجَر من الفائدة التي سيتم تحليلها.
ستظهر نافذة جديدة. انقر فوق إضافة إلى قائمة لتضمين كافة الملفات غير المُزَمَكَم من كل في نقاط زمنية مختلفة وانقر فوق تحميل كمجموعة. يجب أن تظهر كافة الصور في تسلسل واحد.
في إطار لوحة الأدوات، قم بإلغاء تحديد مربع الاختيار مقياس فردي لضبط كافة الصور إلى نفس المقياس، وانقر نقراً مزدوجاً فوق صورة واحدة من التسلسل. لإنشاء منطقة ذات أهمية، في منطقة أدوات الفائدة حدد خيارات كفاف والسيارات واحد، وانقر على شكل الدائرة لوضع الدائرة في وسط إشارة الفلورسنت. انقر على إنشاء لإنشاء منطقة ذات أهمية ونسخ ولصق المنطقة ذات الاهتمام على خلفية حيث لا توجد إشارة.
ثم انقر على قياس المناطق ذات الأهمية وحدد الكل لعرض قيم كثافة الفلورنس لكل منطقة ونسخ هذه القيم ولصقها في جدول بيانات. يتم تحقيق وضع العلامات على شظايا بطانة الرحم عن طريق العدوى بفيروس الغدة التي تم هندستها للتعبير عن mCherry ، وهو بروتين ينبعث منه الفلورانس في القسم القريب من الأشعة تحت الحمراء الذي هو أكثر قوة بكثير من الانسجة الذاتية بطانة الرحم غير المصابة. أثناء الرصد، بالإضافة إلى الطول الموجي المرجعي لـ mCherry، يتم التقاط الصور الفلورية مع أزواج مختلفة من مرشحات الطول الموجي لانبعاثات الإثارة.
لتحديد خصائص الانبعاثات الفلورية الأنسجة ملامح الآفات من الخلفية، وffluorescence المنبعثة من الأنسجة المضيفة، يتم جمع صور الرصد التي تحتوي على الفلوريسين الخام المنبعثة من الحيوانات خلال كل نقطة زمنية معا، غير مخنوق، في ملف واحد. بعد ذلك ، يتم اغتباط fluorescence ، تطبيع ، ويمثل صورة ملونة كاذبة ، ومناطق المصالح المقابلة للفيج محددة وإشارات الخلفية يتم التعرف عليها تلقائيا من قبل البرنامج وكميتها. يتم طرح منطقة خلفية من إشارة الفائدة من منطقة الفيلق من إشارة الفائدة.
ويتم تطبيع نتائج كثافة في كل نقطة زمنية مقابل نقطة الوقت التي كثافة القصوى. بعد عدة أسابيع من الرصد، يمكن استرداد الغرسات القابلة للحياة لمزيد من التحليل المصب. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن تختار تركيز Ad-mCherry الذي يوفر إشارة الأكثر تألقًا دون المساس بقدرة الأنسجة على البقاء.
بعد هذا الإجراء ، يمكن استرداد الآفات واستخدامها لدراسة معلمات مميزة إضافية. تم تحسين هذا الإجراء للمراقبة غير الغازية لآفات بطانة الرحم البشرية xenograft. ومع ذلك، يمكن أن يكون بسهولة التكيف لتقييم آثار أدوية محددة ذات أهمية على مواقع xenograft في الوقت الحقيقي.
