يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول البروتينات الغشاء المتكاملة مثل الدولة القلة، وحجمها، وشكلها الكلي وهيكل القرار المنخفض في الحل. تتطلب دراسات الحل لبروتينات الأغشية تثبيت الجزيئات مثل المنظفات. هذه التقنية لديها ميزة أنه يجعل المنظفات غير مرئية ويسلط الضوء على إشارة من بروتين الغشاء.
الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد إلى العديد من الأسئلة البيولوجية والطبية للبحوث لأن أكثر من 1/3 من البروتينات الموجودة في الأغشية حيث يؤدون العديد من الوظائف الخلوية الحيوية. إن البرهان المرئي على هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية لأن وضع علامات الديوتريوم وخطوات نثر النيوترونات أمر صعب التعلم لأن عدداً قليلاً جداً من المؤسسات يقدم التدريب على هذه التقنيات. للبدء، تحديد النيوترونات نثر كثافة طول أو SLDs باستخدام تطبيق الويب MULCh، وحدات لتحليل بيانات تباين التباين.
افتح وحدة التباين بالنقر فوق التباين الموجود في جزء التنقل الأيمن. توفير نص لعنوان مشروع وأدخل التفاصيل أدناه لمكونين كـ 1 و 1 و 1. أدخل الصيغة الجزيئية لكل مكون في مربع نص الصيغة.
ثم أدخل وحدة التخزين في angstroms مكعب لكل مكون في المربع أدناه حجم. وأخيراً، أدخل تفاصيل مكونات المخزن المؤقت. انقر فوق إرسال لإجراء عمليات حسابية تباين النيوترون.
يتم إنشاء صفحة نتائج توفر جدولاً من كثافة طول التشتت ونقاط مطابقة التباين بالإضافة إلى صيغ لتحديد هذه المعلمات بأي نسبة مئوية معينة من D2O في المخزن المؤقت. راجع معلمات التشتت مع الانتباه بشكل خاص إلى نقاط تطابق تباين المكون. تنمو الخلايا القولونية التي تأوي ناقل تعبير غير قابل للانحسار لتسلسل البروتين المستهدف في LB المتوسطة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر أو OD 600 من واحد تقريبًا.
تكييف الخلايا القولونية إلى الديوتريوم وصفت المتوسطة قبل أن التوسع لأكثر من التعبير عن البروتين deuterated عن طريق تمييع ثقافة LB 1-20 في ثلاثة ملليلتر من الحد الأدنى من المتوسطة. بعد أن نمت إلى OD 600 من واحد تقريبا، كرر واحد إلى 20 تخفيف باستخدام الحد الأدنى المتوسطة التي تحتوي على 50، 75، و 100٪ D2O. تكيف مرة واحدة، ومواصلة زراعة الثقافة في مفاعل حيوي لزيادة العائد من كتلة الخلايا deuterated.
ومع زيادة محتوى D2O، سوف تنخفض معدلات النمو. المضي قدما في الحصاد ، وlyse وتنقية الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص. اربط التالي عمود استبعاد حجم مع أكبر من اثنين من وحدات التخزين العمود من المخزن المؤقت التبادل النهائي باستخدام نظام كروماتوغرافيا السائلة البروتينية السريعة.
بعد حقن العينة، تشغيل العمود في عزل الكسور المقابلة للبروتين من الفائدة. حجز aliquot من العازلة المتطابقة لزاوية صغيرة النيوترونات التشتت أو SANS الطرح الخلفية. لجمع بيانات SANS، قم بتحميل عينات ومخازن مؤقتة في خلايا الكوارتز.
بعد التأكد من أن يتم إغلاق مصراع شعاع، نهج منطقة البيئة عينة ووضع خلايا الكوارتز في المغير عينة. تسجيل موضع مغير العينة لكل خلية عينة. تحقق من المنطقة وتأكد من أن مسار الشعاع خال من العرقلة قبل مغادرة منطقة بيئة العينة.
ثم افتح مصراع الشعاع. تنفيذ فحص جدول لجمع البيانات التلقائية. اتبع التعليمات لتشغيل الجهاز المقدمة من عالم النيوترونات المنتشرة.
استخدام برنامج مانتيد مؤامرة والسيناريو بيثون للحد من البيانات SANS من صورة 2D إلى مؤامرة 1D. للقيام بذلك، قم بتسجيل الدخول إلى الكتلة التحليل البعيد وتنفيذ مؤامرة Mantid من سطر الأوامر. ثم افتح البرنامج النصي المخصص للمستخدم وقم بوضع أرقام المسح الضوئي المقابلة أو تعريف العينة في أزواج المخزن المؤقت في القائمة المناسبة.
تنفيذ البرنامج النصي لإنشاء بيانات مخفضة كملف نصي عمود أربعة في الموقع المحدد. انقر بزر الماوس الأيمن على مساحة العمل المناسبة ومؤامرة Mantid وحدد مؤامرة مع أخطاء لفحص أولي من التشكيلات مبعثر. قم بتنزيل مجموعة برامج ATSAS واستخدم برنامج PRIMUS لتآمر البيانات وتحجيم المخزن المؤقت والطرح وتحليل جينييه.
إطلاق ATSAS، SAS تطبيق تحليل البيانات وتحميل ملفات البيانات المخفضة المقابلة لنموذج وزوج المخزن المؤقت. لتحجيم المخزن المؤقت بشكل صحيح، حدد نطاق البيانات عند Q عالية حيث تتشابه كلا التشكيلات في مسطح وانقر زر المقياس الموجود تحت علامة التبويب العمليات. زيادة نطاق البيانات لعرض كافة النقاط، انقر فوق طرح لتنفيذ هذه العملية.
إجراء تحليل جينييه من البيانات عينة طرح المخزن المؤقت باستخدام علامة التبويب تحليل تطبيق تحليل البيانات SAS. تأكد من تحديد الملف المناسب في القائمة وانقر فوق نصف قطر من gyration. سيتم توفير محاولة تلقائية لتنفيذ ملاءمة Guinier بالنقر على زر RG تلقائيًا.
توسيع نطاق البيانات المستخدمة لتضمين كافة البيانات Q منخفضة والبدء في تضييق نطاق البيانات عن طريق أخذ نقاط Q عالية حتى الحد الأقصى Q مرات RG أقل من 1.3. استخدم قطعة المخلفات للتحقق من أن البيانات خطية في النطاق المناسب. إجراء تعديلات صغيرة على المنطقة المناسبة ومراقبة حساسية هذه القيم لنطاق البيانات المستخدمة في الملاءمة.
الحصول على وظيفة توزيع الاحتمال P من R في جنوم. الآن بدء تشغيل معالج توزيع المسافة ضمن علامة التبويب تحليل. الحصول على ملائمة جيدة للبيانات أمر ضروري للحصول على نموذج الجودة.
تحديد Dmax، المسافة بين الذرية القصوى داخل الجزيء. تقدير قيمة لDmax عن طريق إلغاء تحديد المربع لإجبار Rmax يساوي الصفر وإدخال قيمة كبيرة لDmax. أول تقاطع X في مؤامرة من P من R غلة هذا التقدير.
إجراء تغييرات تدريجية على قيمة Dmax هذه بالإضافة إلى نطاق البيانات المستخدمة لعدد من النقاط المستخدمة لتحسين ملاءمة جنوم للبيانات و P الناتجة من منحنى R. بدء تشغيل معالج الشكل بريموس من زر dammif في علامة التبويب تحليل تحليل بيانات SAS واستخدم مجموعة يدوية من المعلمات. تعريف نطاق جينييه من تناسب والمضي قدما إلى الخطوة التالية باستخدام أزرار التنقل.
تعريف القيم الملائمة من رسم P من R ثم انتقل إلى الخطوة التالية. توفير المعلمات لعملية النمذجة ab initio. ثم قم ببدء العملية باستخدام زر الالتزام.
تراكب فوق المغلف بلا النهائي مع نموذج ذات الصلة عالية الدقة باستخدام supcomb داخل ATSAS. ضع نسخة من طراز PDB عالي الدقة لتكون ملائمة إلى المغلف SANS في دليل العمل. ثم قم بتنفيذ supcomb من سطر الأوامر باستخدام أسماء الملفات PDB كوسيطتين مع بنية القالب المسرودة أولاً.
أخيرا تصور نتائج نموذج AB initio باستخدام PyMOL، وهو برنامج عرض الرسومات الجزيئية 3D. مرة واحدة في SANS المغلف وهيكل عالية الدقة قد تم فرضه، يمكن تصور هذه النماذج باستخدام أي برنامج عرض الرسومات الجزيئية. يتم عرض نظرة عامة على عملية PyMOL التصور.
بمجرد فتح ملفات بنية PDB في PyMOL ، يجب أن تكون النماذج مرئية في نافذة المشاهد PyMOL. يمكن تغيير تمثيلات كل طراز باستخدام الزر S بجوار كل اسم ملف. هنا يتم استخدام تمثيل السطح لمغلف SANS ويتم استخدام تمثيل الرسوم المتحركة للعمود الفقري للبروتين من نموذج القرار العالي.
يمكن اختيار نظام ألوان مناسب من الخيارات المتوفرة تحت الزر C. بالنسبة لسلاسل البروتين، يوفر تلوين االلون تدرج اللون من N إلى C إلى تفسير. يتم تطبيق الشفافية على التمثيل السطحي للسماح بتصور أفضل لبنية البروتين داخل المغلف.
بالنسبة لصور المنشور، يوصى بخلفية بيضاء. مرة واحدة وقد تم تطبيق هذه الإشارات التصور يمكن فحص الهياكل 3D عن طريق النقر على سحب الهيكل. يمكن إجراء التلاعب بالمنظور ودوران الجزيئات والترجمة.
أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن تتذكر أن تتطابق بدقة مع التباين النيوتروني من مجموعات الرأس والذيل المنظفات مع مذيبات H2O D2O. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق لاستكشاف هيكل البروتيات داخل الأراضي. وتشارك هذه البروتينات في الاستجابة المناعية, التهاب الكبد C ومرض الزهايمر.
لا تنس أن العمل في المختبرات الكيميائية الحيوية وفي مرافق شعاع النيوترون يمكن أن يكون خطيرا. الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية واتباع جميع قواعد سلامة المنشأة والبيانات الإشعاعية إلزامية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
