يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تشخيص أمراض النخاع مثل متلازمات النخاع أو أمراض الدم الأخرى التي تتطور مع تشوهات النضج في أنساب الخلايا النخاعية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقلل من موضوعية المحقق في هذا التحليل والتفسير. ويمكن لهذه الطريقة أن توفر نظرة ثاقبة على المعايير الأكثر تميزا بالنسبة لنيلوسبلاسيا.
وهو يسمح بالتكون الكمي للاختلافات من مجموعات الخلايا النخاعية الطبيعية. ومن خلال هذا الإجراء، ستكون تيبهاني بيكو، زميلة ما بعد الدكتوراه من مختبرنا. تبدأ عن طريق خلط 600 ميكرولترات من عينة الخلية الأولية مع 10 ملليلتر من الغسيل العازلة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر لاثنين من الطرد المركزي و 10 ملليلتر من عازلة الغسيل الطازجة في الغسيل.
بعد الغسيل الثاني، إعادة تعليق بيليه في 400 ميكروليتر من العازلة الغسيل الطازجة، ونقل 350 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى أنبوب خمسة ملليلتر بولي بروبلين FACS، التي تحتوي على لوحة كاملة من الأجسام المضادة العمود الفقري. بعد خلط الخلايا بدقة، ماصة وحدات التخزين متساوية من حل الأجسام المضادة الخلية في ثلاثة أنابيب البولي بروبلين جديدة، وتقديم الحجم النهائي في كل أنبوب تصل إلى 200 ميكرولترات مع عازلة الغسيل الطازجة حسب الضرورة. بعد ذلك، إضافة الحجم المناسب من الأجسام المضادة ضد علامات سطح الخلية من الفائدة مع الاختلاط، لاحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة ، أضف ميليتين من محلول المزيج مع الاختلاط ، لاحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، محمي من الضوء. جمع الخلايا الميّزة عن طريق الطرد المركزي، وتجاهل كل ما عدا آخر 50 ميكرولترات من عظمى في كل أنبوب، دون إزعاج بيليه. إعادة تعليق الكريات في كبرى المتبقية، مع خلط لطيف، وإضافة ملليلتر من عازلة الغسيل الطازجة إلى كل عينة.
بعد الغسيل الثاني، تخلص من المابير، تاركة ما يقرب من 50 ميكروليتر الحجم المتبقي في كل أنبوب، دون إزعاج بيليه. إعادة تعليق بيليه في 200 microliters من برنامج تلفزيوني مع الاختلاط، لتحليل فوري. لقراءة العينات على جهاز قياس تدفق، أولاً فتح تجربة جديدة في برنامج مقياس التدفق، وإعادة تسمية التجربة وفقاً لاسم ونوع العينة والتاريخ.
إنشاء عينة جديدة لثلاثة أنابيب، وتحديد الأجسام المضادة المستخدمة في كل أنبوب في تخطيط التجربة. افتح إعدادات مقياس المقاييس، وحدد إعدادات التطبيق، لتطبيق القيم التي تم الحصول عليها في الإعداد الشهري. افتح ورقة عمل عالمية جديدة وأنشئ قطع نقطة مناسبة لـ gating الخلايا المفردة، وكذلك للسكان الحبيبيات، أحادية، الانفجار، والخلايا اللمفاوية.
إنشاء ورقة عمل عمومية جديدة لعناصر التحكم في التعويض. ثم، الحصول على 500،000 الأحداث من كل أنبوب، بمعدل اقتناء متوسطة، وتصدير البيانات كملفات fcs 3.0، بعد التحقق من صحتها التقنية. قبل البدء في تحليل جديد، قم بتنزيل ملفات الخلايا التي تحتوي على بيانات نخاع العظم العادية، للعدلات، أحادية، وأنساب حمراء نوية، وملفات التحليل في شكل INP.
ثم احفظ البيانات على سطح المكتب. من أجل حفظ نضوج العدلات إلى قاعدة البيانات، أولاً فتح برنامج Infinicyt ثم قم بفتح ملف الخلايا المقابلة لبيانات نضوج العدلات. رسم مسار النضج على الرسم البياني APS، وحفظ مسار نضوج العدلات إلى قاعدة البيانات.
فتح ملف fcs لنضوج النسب العدلات التي يجب تحليلها. تحميل ملف inp نضوج العدلات من علامة التبويب ملفات التعريف. وينقسم تحليل هذا النسب إلى ثلاث خطوات.
ابدأ باختيار التفجيرات الإيجابية التي تُرتكب في CD34. لهذا الهدف ، واستخدام تقاطع سبع بوابات ، للسماح لاختيار CD34 إيجابية ، CD117 إيجابية ، HLADR منخفضة ، CD10 السلبية ، CD13 إيجابية ، CD11 ب السلبية الأحداث. مواصلة التحليل مع اختيار CD117 إيجابية, CD34 السلائف العدلات السلبية.
مواصلة التحليل مع اختيار خلايا العدلات أكثر نضجا. المقبل، وتظهر تحليل خلايا النسب أحادية. رسم مسار النضج على الرسم البياني APS.
تحقق من أن السهم يشير إلى الشعور بالنضج موجه من خلايا غير ناضجة، أحادية، CD14 سلبية، IREM2 سلبية، إلى أحاديات ناضجة، CD14 إيجابية، IREM2 إيجابية. حفظ مسار نضوج النسب أحادية إلى قاعدة البيانات. فتح ملف fcs لنضوج النسب أحادية التي يجب تحليلها.
قم بتحميل ملف التعريف لتحليل النسب الأحادي. لتحديد خلايا النسب أحادية، استخدم تقاطع أربع بوابات التي تسمح باختيار CD64 إيجابية عالية، CD117 إيجابية، CD117 السلبية، HLADR الأحداث الإيجابية. تعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب أحادية في شجرة التسلسل الهرمي للفئات.
افتح ملف cyt NRC الذي يجب حفظه في قاعدة بيانات NRC. رسم مسار النضج على الرسم البياني APS، وحفظ الخلايا الحمراء النووية نضوج المسار إلى قاعدة البيانات. افتح ملف fcs الذي يجب تحليله.
تحميل من التشكيلات قالب تحليل الخلايا الحمراء النووية. وينقسم تحليل هذا النسب إلى خطوتين. بدءا من اختيار CD34 إيجابية ، إريثرويد التفجيرات ارتكبت.
هنا ، استخدم تقاطع سبع بوابات للسماح باختيار CD34 إيجابية ، CD117 إيجابية ، HLADR منخفضة ، CD105 إيجابية ، CD33 السلبية ، CD36 إيجابية ، CD71 الأحداث الإيجابية. تعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب NRC في التسلسل الهرمي للفئات. إزالة انفجار 34 erythroid إيجابية ارتكبت من الرؤية.
لتحديد خلايا erythroid أكثر نضجا ، واستخدام تقاطع أربع بوابات التي تسمح التمييز من CD45 السلبية وD45 إيجابية منخفضة ، الجانب مبعثر منخفضة ، CD36 عالية إيجابية ، و CD71 إيجابية عالية. ثم، إزالة الجانب CD36 عالية مبعثر الصفائح الدموية المنخفضة من الخلايا الحمراء النووية، وتعيين هذه السكان إلى علامة التبويب NRC. لتقييم النضج النخاعي في حجرة نخاع العظام، افتح ملف الخلايا المقابلة ل نسب الاهتمام من الحالة التي يجب تقييمها.
الاحتفاظ بالأحداث المعينة إلى علامة التبويب العدلات في شجرة التسلسل الهرمي للفئات فقط مرئية. رسم مسار النضج على الرسم البياني APS وتحميل قاعدة البيانات المقابلة لنضوج العدلات في نخاع العظام العادي، ومقارنة البيانات. إذا كانت البيانات متوافقة جزئياً على الأقل، سيقوم البرنامج بإنشاء مخطط اختلافات نضوج تطبيع، و شريط معلمة، لتصور الاختلافات النضج.
لمقارنة نضوج أحاديات في حجرة نخاع العظام، بالنسبة لحالة جديدة مع البيانات من نخاع العظام العادي، بما في ذلك في قاعدة بيانات أحادية الخلايا، افتح ملف الخلايا المُقابلة لـ سلالة الخلايا الأحادية. الاحتفاظ بالأحداث المعينة إلى علامة التبويب أحادية في شجرة التسلسل الهرمي للسكان مرئية، ورسم مسار النضج على الرسم البياني APS. قم بتحميل قاعدة البيانات المطابقة لنضوج أحاديات في نخاع العظم العادي، وقارن البيانات.
لمقارنة الخلايا الحمراء المنضجة في حجرة نخاع العظم، بالنسبة لحالة جديدة، مع بيانات من نخاع العظم العادي، المدرجة في قاعدة بيانات NRC، افتح ملف الخلايا التي تتوافق مع نسب NRC. الاحتفاظ بالأحداث المعينة إلى علامة التبويب NRC في شجرة التسلسل الهرمي للفئات مرئية فقط. ورسم مسار النضج على الرسم البياني APS.
قم بتحميل قاعدة البيانات المطابقة لنضوج NRC في نخاع العظم العادي، وقارن البيانات. ثم، لتصور أهمية الاختلافات بين الملف الجديد والبيانات المضمنة في قاعدة البيانات، انقر فوق اختلافات النضوج المُتسوى والتكبير. تذكر أن الأساليب التي تستخدم خوارزميات التصنيف الهرمي في تحليل البيانات الخلوية التدفقية ذاتية للغاية وغير دقيقة بطبيعتها ، لأنها لا تحسب تداخل مجموعات الخلايا.
تقييم الحالات الجديدة من السيتوبينيا، يشتبه في أن MDS ضد قواعد بيانات النضج الطبيعي النخاعي، تسمح لتحديد مستضدات النضج غير طبيعية التعبير عنها من العدلات، monocyte، وNRC النسب، حتى في الحالات دون تشوهات الخلايا أو الخلايا. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن نكتسب البيانات السيتوميترية تدفق، بطريقة موحدة، لأداء إعداد الإعداد cytometer الشهرية، والشيكات اليومية، إلى ماصة بدقة الأجسام المضادة قبل الاستخدام، واحترام الأوقات تلطيخ. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل البوصلة، لمقارنة مجموعة مختلفة من الحالات، والإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما هي بصمة الطابعة النهائية لمجموعة معينة من الحالات.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين المهتمين باستكشاف أنماط نضوج الخلايا النخاعية ، في حالات الدم الانسيابي من الإمكانات غير المتخصصة لتحديد التغييرات الطابعية النهائية ذات الصلة بشكل موثوق لعملية dysplastic. يرجى ملاحظة أن تحديث قاعدة البيانات مع زيادة عدد البيانات من الجهات المانحة السليمة قد يحسن من قوة التحليل.
