ونحن نشكر "ريتا المستحضرات الصيدلانية" لتوفير كدو-مديرة. كما نعترف بالدعم لجين ولي الرئاسة سيدمان في "طب السرطان الابتكار" (جون ليتيريو). هذا العمل كان تدعمها وزارة الدفاع [W81XWH-12-1-0452]؛ مبادرة بحوث السرطان الكبار فاولر إنجي المراهقين والشباب في مركز السرطان الشامل في القضية؛ وجائزة الباحث خريج كالاهان وي جو الجمعيتان من مؤسسة كالاهان إف جي.

وأجريت جميع الدراسات وفقا للإجراءات التي أقرتها القضية Western Reserve كلية الطب بجامعة لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة.
1. إعداد الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم (بمدكس)
<ol><li>تعقيم كل الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم وإجراء التجربة في فئة السلامة البيولوجية الثاني مجلس الوزراء مع إجراءات السلامة المعتمدة.</li>
	<li>Euthanize الفئران C57BL/6 8-10 أسابيع عمر باستخدام الدائرة2 CO. ضع الماوس على متنها تشريح وشطف مع الإيثانول 70%. المكوس عظام الشظية الساق والفخذ باستخدام مقص جراحي ووضعها مع الإيثانول 70% في صحن ثقافة 10 سم.</li>
	<li>استخدام شفرات الجراحية وملقط تشريح الأنسجة بعيداً قدر الإمكان على غطاء 10 سم الثقافة الطبق وعزل تيبياس وقصبة وضعها مع الإيثانول 70% في صحن ثقافة 6 سم.</li>
	<li>استخدام شفرات الجراحية لتقليم كلا طرفي تيبياس وقصبة. استخدام 3 مل برنامج تلفزيوني في محقن 3 مللي بإبرة ز 23 لمسح محتويات نخاع من واحدة من نهاية العظام إلى أنبوب مخروطي الشكل يحتوي على 12 مل برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة 3 x لكل طرف من أطراف العظام.</li>
	<li>الطرد المركزي بتعليق خلية في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية مع ACK 1 مل ليسينج المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق لإزالة خلايا الدم الحمراء.</li>
	<li>إضافة 9 مل برنامج تلفزيوني تمييع ACK ليسينج المخزن المؤقت والطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>إزالة المادة طافية وريسوسبيند مع 10 مل الثقافة المتوسطة (RPMI 1640 بالإضافة إلى الجلوتامين ل 10% FBS، 1% من الأحماض الأمينية غير الأساسية (100 x)، 10 ملم حبيس، 50 نانومتر β-ميركابتوثانول والبنسلين/ستربتوميسين 5%). ملاحظة: مستوى الذيفان يجب أن تكون أقل من 0.1 مليلتر الاتحاد الأوروبي في FBS.</li>
	<li>يمر بتعليق خلية مصفاة خلية 40 ميكرومتر واتخاذ 20 ميليلتر من تعليق خلية وتخلط مع 80 ميليلتر من تريبان الأزرق لعد عدد الخلايا الحية باستخدام سيتوميتير.</li>
	<li>ضبط عدد الخلايا إلى 1 × 106 خلايا/مل مع 15 نانوغرام/مليلتر GM-CSF و 10 نانوغرام/مل إيل-4.</li>
	<li>لوحة 3 مل من 1 × 106 خلايا/مل في كل من لوحة 6-جيدا جيدا واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2و 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO. ملاحظة: خلايا النخاع العظمى من الماوس واحد حوالي 3-5 × 107 الخلايا، مما يشير إلى أنها يمكن أن توضع من 2 إلى 3 6-جيدا لوحات.</li>
	<li>في يوم 3، إزالة جميع المتوسطة الثقافة 3 مل من كل بئر، إضافة 2 مل برنامج تلفزيوني جديد في كل بئر، ومن ثم بلطف دوامة لوحة لضمان إزالة كافة الخلايا غير ملتصقة.</li>
	<li>استبدال 3 مل الطازجة الثقافة المتوسطة مع 15 نانوغرام/مليلتر GM-CSF و 10 نانوغرام/مل إيل-4 في كل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2و 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO.</li>
	<li>في يوم 5، مباشرة إضافة آخر 3 مل الطازجة المتوسطة الثقافة مع 15 نانوغرام/مليلتر GM-CSF و 10 نانوغرام/مل إيل-4 في كل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2، 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO. ملاحظة: الحجم الإجمالي في كل بئر الآن 6 مل.</li>
	<li>في يوم 7، وضعت لوحة كاملة على الجليد لمدة 10 دقائق. بلطف "الماصة؛" المتوسطة الثقافة في كل بئر لإزاحة شكل فضفاض-تمسكا بمدكس كالبلدان الجزرية النامية في التعليق. ملاحظة: لا يزال يتم إرفاق الضامة ملتصقة باللوحة. درجة الحرارة منخفضة والإجراءات بلطف هي المفتاح لتجنب التنشيط DC للتأثير على مزيد من التجارب.</li>
	<li>الطرد المركزي من تعليق خلية في 300 غرام x لمدة 5 دقائق وريسوسبيند مع المتوسطة ثقافة جديدة لإجراء مزيد من التجارب. ملاحظة: يمكن تحديد بمدكس بجسم CD11c fluorescence المسمى بالتدفق الخلوي واظهرنا استراتيجيتنا النابضة من بمدكس لتجارب أخرى في الشكل 1.</li>
</ol>2-تميز تولدك الجينات والبروتين الشخصية
<ol><li>لوحة 2 مل من 1 × 106 بمدكس/مل كل بئر في البئر 6-لوحة مع الثقافة المتوسطة في وجود أو عدم وجود 100-400 نانومتر كدو-مديرة لحضانة ح 1 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO. ملاحظة: كدو-مديرة، تريتيربينويد اصطناعية، عامل نووية (المستمدة من محمر 2)-مثل-2 (Nrf2) عامل محفز ومثبط النووية عامل-κB (NF-κB). تطبيق العوامل الأخرى لتحريض تولدكس من البلدان الجزرية النامية، مثل إيل-10، وفيتامين D3، الديكساميتازون أو خليج 11-7085، وتعديل هذه الخطوة بشرط أمثل لكل عامل.</li>
	<li>إضافة 10 أو 100 نانوغرام/مليلتر من لبس تفرخ 4-24 ساعة للحث على مدكس (وقت الحضانة مختلفة بسبب القياس مرناً أو البروتين).</li>
	<li>بلطف "الماصة؛" المتوسطة الثقافة في كل بئر والحصاد تعليق خلية باستخدام ماصة 1 مل. الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا والمادة طافية، على التوالي.</li>
	<li>تحليل يغاندس السطحية من الكريات الخلية بالتدفق الخلوي، مثل يغاندس تنشيطية: CD40، CD80، CD86، MHC-ثانيا، OX40L، إيكوسل، أو يغاندس المثبطة: PD-L1، PD L2، ILT3، ILT4.</li>
	<li>عزل الحمض النووي الريبي من الكريات الخلية وتحليل الحمض النووي الريبي وعينات طافية على المستويات الشخصية والجينات والبروتين سيتوكين الكمي PCR الوقت الحقيقي (قرة-PCR) وإليزا، على التوالي. ملاحظة: على سبيل المثال، السيتوكينات الالتهابية: السيتوكينات تنف-α، IFNγ، EDN-1، وايل-6، وايل-12، وايل-23، أو المضادة للالتهابات: إيل-4، وايل-10، إيل-15، TGF-β1، وهو 1.</li>
</ol>3-تقييم وظيفة تولدكس في المختبر و في فيفو
<ol><li>
تي خلية انتشار سينجينيك الإنزيم
	<ol>
<li>تعقيم كل الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم وإجراء التجربة في فئة السلامة البيولوجية الثاني مجلس الوزراء مع إجراءات السلامة المعتمدة.</li>
		<li>إعداد أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت باستخدام 0.5% ألبومين المصل البقري (BSA) و 2 مم يدتا في 500 مل برنامج تلفزيوني. تعقيم المخزن المؤقت عن طريق التصفية عن طريق فلتر 0.2 ميكرون. ملاحظة: الاحتفاظ المخزن المؤقت على الجليد خلال التجربة التالية.</li>
		<li>للحصول على خلايا CD4+ تي euthanize الخلايا، OT-تي الثاني خلية الفئران المعدلة وراثيا مستقبلات (تكر) 8-10 أسابيع عمر باستخدام الدائرة2 CO. ضع الماوس على متنها تشريح وشطف مع الإيثانول 70%. عزل الطحال من الجانب الأيسر للبطن باستخدام المقص الجراحي والملقط.</li>
		<li>وضع الطحال مع 2 مل برنامج تلفزيوني في صحن ثقافة 6 سم واستخدام الجزء الخلفي من دفع عصا محقن 3 مللي فرم الطحال بتمرير مصفاة خلية 40 ميكرومتر.</li>
		<li>جمع في تعليق خلية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه الخلية في ميكروليتر 400 من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش.</li>
		<li>إضافة 100 ميكروليتر من خلايا CD4+ "كوكتيل" البيوتين-جسم الخلية T عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ملاحظة: ربط جسم كوكتيل في أنواع الخلايا الأخرى ما عدا خلايا CD4 خلايا+ T، مثل CD8a، CD11b، CD11c، CD19، CD25، CD45R (B220)، CD49b (DX5)، CD105، MHC مكافحة الدرجة الثانية، مكررا ثانيا-119، و TCRγ/δ.</li>
		<li>إضافة 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش و 200 ميكروليتر من حبات البيوتين المضادة (جدول المواد) عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.</li>
		<li>مكان يتألف العمود من المجالات المغناطيسية (جدول المواد) وفصل ما قبل "تصفية" معا في المغناطيسي الميدانية وشطفه مع 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش.</li>
		<li>إضافة 9 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش في الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وتطبيقه على العمود. جمع التدفق من خلال خلايا CD4 التي تحتوي على+ تي الخلايا.</li>
		<li>أغسل العمود مع آخر 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وجمع أيضا التدفق من خلال.</li>
		<li>للحصول على وحدات تحكم المجال Dc عموم الطحال، euthanize الفئران C57BL/6 8-10 أسابيع عمر باستخدام الدائرة2 CO. ضع الماوس على متنها تشريح وشطف مع الإيثانول 70%. عزل الطحال من الجانب الأيسر للبطن باستخدام المقص الجراحي والملقط. وضع الطحال في صحن ثقافة 6 سم يحتوي على 2 مل من محلول كولاجيناز د (2 مغ/مل كولاجيناز د حله في حبس المحتوية على الكالسيوم والمغنيسيوم).</li>
		<li>حقن 1 مل من محلول كولاجيناز د إلى الطحال مرتين مع 1 مل حقنه وابرة 25 جرام. قطع الطحال إلى قطع صغيرة مع مقص صغير.</li>
		<li>اهتز واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.</li>
		<li>إضافة 500 ميكروليتر يدتا 0.5 م في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ملاحظة: الخطوات من 3.1.13-3.1.14 ذات أهمية حاسمة لزيادة العائد من وحدات تحكم المجال Dc.</li>
		<li>الآن استخدام الجزء الخلفي من دفع عصا محقن 3 مللي فرم الملاط الطحال بتمرير مصفاة خلية 40 ميكرومتر وجمع تعليق خلية سينتريفوجينج على 300 غرام x لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه الخلية في ميكروليتر 350 المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش، 50 ميكروليتر من كاشف حظر FcR و 100 ميكروليتر من الخلية الجذعية عموم جسم البيوتين "كوكتيل" عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ملاحظة: جسم كوكتيل ضد المستضدات التي لا يتم التعبير عنها بوحدات تحكم المجال Dc.</li>
		<li>غسل الخلايا بإضافة 9 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وأجهزة الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه الخلية في ميكروليتر 800 من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وإضافة 200 ميكروليتر من حبات البيوتين المضادة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.</li>
		<li>كرر الخطوات من 3.1.9-3.1.11 لجمع وحدات تحكم المجال Dc.</li>
		<li>أغسل العمود مع آخر 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش مرتين وجمع أيضا التدفق من خلال.</li>
		<li>علاج 2 × 105 وحدات تحكم المجال Dc/مل في وجود أو عدم وجود خلايا تي 100-400 نانومتر كدو-مديرة في 37 درجة مئوية للتسمية CD4، بشكل منفصل في الساعة 1+ (1 × 107/ml) مع 1 ميكرومتر كفسي في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني ، وإعادة ضبط وحدة التخزين للحصول على التركيز النهائي في6 ر 2 x 10 خلايا/مل.</li>
		<li>المقبل، في لوحة 96، حسنا، الثقافة شارك 100 ميكروليتر من الخلايا الجذعية تعامل مع نفس الحجم من المسمى كفسي CD4 الخلايا+ T، سواء التي تم جمعها من الخطوات المذكورة أعلاه للحصول على 01:10 نسبة. الآن إضافة 100 نانوغرام/مليلتر الببتيد أوفالبومين (OVA) 323-329 كل بئر وقياس كثافة كفسي الخلايا T بالتدفق الخلوي بعد 2-3 أيام للحضانة. ملاحظة: الأرقام الخلية ونسبة من وحدات تحكم المجال Dc و T وقد تم تحسين الخلايا من أن العمل السابق37.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
حمل السلبي ع عن طريق حقن بمدكس نابض بروتين سكري Oligodendrocyte المايلين (موج) (35-55)
	<ol>
<li>لوحة 2 مل من 1 × 106 بمدكس/مل كل بئر في البئر 6-لوحة مع الثقافة المتوسطة في وجود أو عدم وجود 100-400 نانومتر كدو-مديرة لحضانة 1 ساعة.</li>
		<li>إضافة 10 نانوغرام/مل من لبس تحضين 24 ساعة.</li>
		<li>إضافة 100 ميكروغرام/مل من موج (35-55) تحضين 4 ساعات.</li>
		<li>الحصاد في تعليق خلية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه الخلية مع برنامج تلفزيوني وحساب الخلايا.</li>
		<li>تحت الجلد حقن 200 ميكروليتر من 2 × 106 خلايا للفئران C57BL/6 الإناث 8-10 أسابيع من العمر (100 ميكروليتر في كل الساق الخلفية).</li>
		<li>في اليوم من حقن بمدك و 48 ساعة. في وقت لاحق، ضخ 200 نانوغرام من السعال الديكي السمية (PTX) في كل الماوس.</li>
		<li>كرر الخطوات 3.2.6-3.2.7 مرة كل أسبوع لمدة 4 أسابيع متتالية.</li>
		<li>تقييم الأعراض السريرية من ع يوميا باستخدام المعايير القياسية37 (0.5-يعرج ذيل، الذيل 1-يعرج، ضعف أطرافهم هند 2-معتدلة، أطرافهم هند 3-شديدة الضعف، والشلل أطرافهم هند 4 كاملة، الدولة 5-الرباعي أو تحتضر، 6-وفاة).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

وتصف هذه الورقة على بروتوكول فعالة التي يمكن استخدامها لتكاثر لتوليد البلدان الجزرية النامية وبعد ذلك التفريق بينهم في تولدكس، ونقترح أن هذا يمكن تطبيقها على تقييم قدرة وكلاء الهدف جزيئية جديدة للحث تولدك النمط الظاهري. وكما هو مبين في هذا التقرير، تابعنا تسلسل التي نحن أولاً تحليل التعبير تولدك من يغاندس السطحية بالتدفق الخلوي، يليه تقييم للشخصية سيتوكين DC مقاسا qRT-بكر وإليزا. وأخيراً، أكد وظيفة إيمونوريجولاتوري تولدكس مما يدل على قدرتها على خفض تي خلية انتشار في المختبر وفعاليتها لقمع المناعة الذاتية الحية، باستخدام نموذج ع مورين الإكلينيكية لمرض التصلب العصبي المتعدد.
لدينا بروتوكول، ولدت البلدان الجزرية النامية ومتباينة من السلائف موريني نخاع العظام مع المزيج من GM-CSF، وايل-4. استخدمت بروتوكولات أخرى مثل أشكال تيروزين كيناز 3 يغاندس (Flt3L) في الأجلين المتوسط والثقافة لإنشاء44من البلدان الجزرية النامية. على الرغم من أن استخدام Flt3L يزيد العائد من البلدان الجزرية النامية، هذه البلدان الجزرية النامية عادة ما تأخذ 2 أيام (9 أيام) للحصاد، بالمقارنة مع GM-CSF/إيل-4 إضافة (7 أيام)44. الأهم من ذلك، تفرق iDC المتولدة من Flt3L في كثير من الأحيان في كلا المؤلفان (CD8– و CD8+) و pDCs45 التي كانت وظيفيا ومكافئات للحالة المستقرة DCs المجراة في فينوتيبيكالي. غير أن يستحث GM-CSF/إيل-4 دائماً التفريق بين مركز البيانات الدولي تجاه المؤلفان (CD8–) إلا44 وأثناء النضج، أظهروا أحرف مشابهة ل وحدات تحكم المجال Dc التحريضية46. جدير بالذكر أن تعرف أن GM-CSF/إيل-4 غالباً ما تستخدم في التجارب السريرية والبحوث الأساسية بسبب الاستفادة من التمييز بين وحدات تحكم المجال Dc وحيدات أو CD34+ المتكفل44. فقد ثبت أن البلدان الجزرية النامية المتولدة من هاتين الطريقتين إنتاج خلايا مختلفة شكلياً، التي تمتلك علامات سطح خلية مختلفة أيضا ويحمل ملامح متميزة سيتوكين عند انتهاء التنشيط. وعلاوة على ذلك، تولدكس الناجم عن هذه الأساليب تختلف في قدرتها على ترحيل استجابة لعوامل تشيموتاكتيك والحث على خلية محددة مستضد تي الردود44،45. ونحن نفهم أن CD8+ وحدات تحكم المجال Dc قد يحمل إمكانيات أكبر في تحريض تولدك بسبب قدرتها الفريدة على كروستوليرانسي47. بيد أنه مطلوب ثم كذلك الخلية الفرز من بمدكس المستمدة من Flt3L للتحقيق CD8 محددة+ DC فرعية. وبالإضافة إلى ذلك، منذ ذلك الحين، التي يسببها GM-CSF/إيل-4 بمدكس متفوقة في تحفيز الخلايا T وإنتاج وسطاء التهابات بعد لبس المعاملة44،45، وجدنا أن هذه الاستراتيجية أعطت المزيد من النتائج استنساخه أعمالنا التجارب.
بمدكس المستمدة من البداية GM-CSF/إيل-4 للتعبير عن CD11c حول يوم 4 وإثراء التعبير بعد يوم 648. يمكن أن يستمر هذا الإجراء الثقافة حتى اليوم 10-12 مع أقل كثافة طلاء من خلايا نخاع العظام وانخفاض جرعة من جي أم سي-سادس يوم 8-1049. في هذا البروتوكول، أضيفت كدو-مديرة (triterpenoid الاصطناعية) ولبس بالترادف كوكلاء للحث على التسامح DC والنضج، على التوالي. ونحن أفادت مؤخرا أن البلدان الجزرية النامية حصادها من الثقافات استخدام هذا الأسلوب من جيل بمدك المعرض تولدك وظيفية النمط الظاهري عند pretreated مع كدو-مديرة37. جدير بالذكر أن كدو-مديرة، الذي أضيفت فقط للثقافات بعد الحصاد أي دي سي (يوم 7)37، خلافا لعوامل مثل فيتامين D3 التي يجب أن تضاف إلى ثقافات عدة مرات خلال iDC التمايز (اليوم 2، 4، 6)50. وعلاوة على ذلك، قد يتوقف هذا تحريض تولدكس من فيتامين D3 على الآليات المتنوعة التي يجب أن تبدأ على حد سواء أثناء وبعد iDC التمايز51. البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن إضافة كدو-مديرة خلال التمايز iDC لم يكن له تأثير على نقاء CD11c + "وحدات تحكم المجال Dc"، لكن الجرعة [دبندنتلي] انخفاض العائد من البلدان الجزرية النامية في يوم 7 (البيانات لا تظهر). تحليلاتنا تشير أيضا إلى أن تركيز أعلى من كدو-مديرة المستخدمة في هذه التجارب قد تكون سامة للخلايا السلف نخاع العظام، على الرغم من أن iDC أظهر بقاء طبيعية مع هذا التركز من كدو-مديرة37. ومن المتوقع أنه يمكن تحسين التعريفي تولدك بتحليلات دقيقة أثر توقيت ومدة التعرض لعوامل مثل كدو-مديرة.
من المهم النظر في طرق بديلة والآليات التي من خلالها يمكن أن يتسبب البلدان الجزرية النامية على مدكس قبل الآخرين من لبس، مثل CD40L وتنف-α, IFN-γ52. نضوج DC بلبس من خلال المستقبلات الشبيهة بعدد القتلى 4(TLR4) يؤدي تنشيط عدة عوامل النسخ، بما في ذلك النووية عامل-κB (NF-κB)، وبروتين mitogen تنشيط p38 كيناز (p38 MAPK)، كيناز ج-ن يونيو--المحطة الطرفية (جنك)، وخارج الخلية ينظم إشارة البروتين كيناز (ERK1/2). نضوج وحدات تحكم المجال Dc CD40L وتنف-α عن طريق مستقبلات CD40 وتنف الحث على التوالي في مسار NF-κB. وفي المقابل، IFN-γ يحفز طريقا مختلفة بما في ذلك تفعيل يانوس كيناز (جاك)، تيروزين كيناز (تيك)، ومحول الإشارات والمنشط البروتينات النسخ (إحصائيات)، وهذه الآثار المصب تكملها أيضا تنشيط من مسار NF-κB52. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما الشخصية التعبير الجيني نضج DC CD40L/تنف-α-تعتمد يوحي بأن هذه وحدات تحكم المجال Dc استقطاب الخلايا T نحو استجابة خلايا Th253، نضوج DC ب IFN-γ هو بقوة منحازة استجابة خلايا Th154. ولذلك، وهذه المحرضات الأخرى من النضج DC التي ترتبط بالتمايز تجاه مجموعات فرعية محددة T الخلية لا يعمل في هذا البروتوكول.
وقد أظهرت عدة تقارير أن السابقين فيفو-DCs متمايزة قادرة على استحثاث الطيف الكامل من ع الأعراض السريرية وعلم الأمراض في الفئران55. وقد اعتمد أسلوب الحث ع السلبي السابقين فيفو تنشيط وحدات تحكم المجال Dc مع تعديلات مختلفة من قبل مختبرات مختلفة. مزيج الاستقراء ع السلبي والإيجابي بإدارة موج معبي بمدكس، 7 أيام قبل التحصين مع موج والنتائج كاملة فروند الشعبية adjuvant (CFA) في أعلى درجات الأعراض السريرية (ذروة نقاط سريرية: 3.5) مقارنة ع السلبي التعريفي بإدارة موج معبي بمدكس وحدها (ذروة نقاط سريرية: 2)56. النتائج مع هذا الأسلوب يجمع بين موج معبي بمدكس بموج تقترح التحصين يحدث أن ظهور المرض في يوم 9 بعد التحصين مع موج وفرنكات الجماعة المالية الأفريقية56. ومع ذلك، حيث من المعروف أن فرنكات الجماعة المالية الأفريقية يسبب التهاباً كبيرا في موقع الإدارة57، نحن استخدمت السلبي ع التعريفي الإدارة من وحدات تحكم المجال Dc وحدها في لدينا بروتوكول بغية تحليل فعالية تأثير تولدكس خلال ع. بغية زيادة تأكيد النمط الظاهري الوظيفية من تولدكس، أحد يجب أيضا اختبار لهم في قمع الأعراض السريرية النشطة EAE الفئران. مسار الإدارة من وحدات تحكم المجال Dc الأهمية أيضا إلى تنظيم دورات تعريفية ل الأعراض ع58. كما ذكرت لدينا مختبر وآخرون، يستحث الحقن تحت الجلد من بمدكس في منطقة الجناح في الفئران C57BL/6 مرة واحدة في أسبوع لمدة 3-4 حقن نقاط ذروة سريرية من ع حول 2-2.5 مع بداية المرض استنساخه في اليوم 11-1237 ،58. وقدمنا مقطع قصير لإظهار أعراض سريرية مختلفة بين الإيجابي والسلبي EAE التعريفي (1 فيديو).
وتشمل القيود المعترف بها لدينا بروتوكول الوقت المطلوب بالأساليب المستخدمة، والاعتماد على المكروية ذات صلة غير الفيزيولوجية للتمايز بمدك. ومع ذلك، بينما أثرت الجسم عمود فصل أساليب جمع لوحدات تحكم المجال Dc وخلايا تي من مورين الطحال قد يكون الوقت أكثر كفاءة، فإنه يعاني من عائد منخفض من سكان العاصمة المنشودة. وهكذا، هو استفادة أسلوب تنمية العاصمة المشتقة من نخاع العظم سجل مقياس العائد أعلى من سكان العاصمة عند مقارنتها بجسم العمود فصل عن الطحال كلها. وكما لوحظ أعلاه، وحدات تحكم المجال Dc التي تم إنشاؤها في المختبر باستخدام هذه الطريقة يتطلب تركيزات عالية من مكملات سيتوكين التي ليست ذات الصلة الفيزيولوجية لوحدات تحكم المجال Dc في فيفو المكروية59 وأيضا لا ضمان على المدى الطويل الاستدامة للعاصمة. الخدمات القطرية الآلية المستخدمة في البروتوكول لدينا أيضا ليست سيتوكين أساسية العادية DC التمايز في فيفو60. ومع ذلك، البروتوكول المقترح في جيل بمدك تكاثر تعطي نسبة عالية من تولدكس وظيفيا وينبغي أن ينظر إليها كوسيلة موثوق بها للغاية واستنساخه لتوليد DCs الوظيفية مع خصائص توليروجينيك.
وفي الختام، تولدكس المتولدة من البروتوكول هو موضح هنا يمكن فعالة تتسم بتقييم ملفاتهم تعبير الجينات والبروتين وتحديد قدرتها على أن تعدل خلية T-تعتمد على الاستجابات المناعية في المختبر، تقييم وظيفتها كعلاج خلية التبني لقمع ع التعريفي في فيفو. لدينا بروتوكول يوفر إطارا لتقييم أي العوامل الجديدة التي يعتقد أن لها القدرة للحث على تولدكس وكذلك التعجيل بعملية التنمية العلاجية تولدكس من مقاعد البدلاء إلى العيادة.

الخلايا الجذعية (DCs) هي جزء لا يتجزأ من نظام المناعة الفطرية وأول مرة اكتشفت وتميزت رالف ستينمان وزانفيل كوهن في عام 1973 كما عرض مستضد المهنية الأولية الخلايا1. وحدات تحكم المجال Dc قد ثبت أن تلعب دوراً مهما في تنشيط محصنة بتقديم المستضدات المجهزة للخلايا T والخلايا ب عن طريق المجمعات الكبرى histocompatibility (MHC) في الأجهزة اللمفاوية الثانوية لربط نظم المناعة الفطرية وتكيفية2. في الثدييات المناعي، هناك فئتين على الأقل من وحدات تحكم المجال Dc التي وصفت بأنها النقوي وحدات تحكم المجال Dc وبلاسماسيتويد DCs (pDCs)3. وحدات تحكم المجال Dc النقوي، أيضا يعرف باسم Dc التقليدية (المؤلفان)، تتميز بالتعبير عن CD11c ويمكن أن تكون متباينة DCs (البلدان الجزرية النامية) غير ناضجة في المختبر من خلايا السلف نخاع العظام أو الدم المحيطي وحيدات باستخدام عامل المحببات-بلعم-مستعمرة-حفز (GM-CSF)، وايل-4 في الأنواع موريني أو البشرية، على التوالي4.
تفعيل 'خطر' إشارات، مثل أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (بمب) أو أنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (الرطوبة)، سوف تدفع البلدان الجزرية النامية النضج تجاه DCs مكسبه ناضجة DCs (مدكس) عبر ملزم مستقبلات الاعتراف بنمط مختلف سطح DC5. DCs مكسبه كذلك رئيس الوزراء تكاثر الخلايا T ساذجة والتمايز من خلال أوبريجوليشن مهسيي2، يغاندس كوستيمولاتوري (CD80 و CD86 و CD40)6، السيتوكينات، وسائر الوسطاء للذوبان7. سلسلة من الوسطاء المحترفين التهابات الإنتاج من "وحدات تحكم المجال Dc مكسبه" ضروري للتمايز سيتوكين بوساطة الخلايا T. على سبيل المثال، IFN-γ وايل-12 ضرورية ل التمايز Th18 و IL-1، إيل-6، وايل-23 حاسمة بالنسبة للسذاجة خلية T الاستقطاب نحو خلايا Th179. رغم DCs ناضجة الرد على المستضدات الأجنبية، غير المنضبط DC التنشيط بواسطة المستضدات الذاتية قد تسبب التذرية التسامح وتعزيز التنمية لأمراض المناعة الذاتية عن طريق توليد خلايا أوتوريكتيفي تي التنشيط الذي يؤدي إلى تدمير الأنسجة10 .
وقدمت التقارير الأخيرة دليل واضح على اللدونة DC، يتجلى في قدرتها على التفاعل مع إشارات مختلفة داخل بهم المكروية الأنسجة والتفريق إلى مجموعات فرعية متميزة المستجيب/القامع DC. الوسطاء للالتهابات، مثل TGF-β12، إيل-1011و 1 هو13 تبين أن تلعب دوراً مهما في قمع المناعة بحمل توليروجينيك DCs (تولدكس). هذه تولدكس الحصول على المهام التنظيمية وقمع انتشار الخلايا T14. وعلاوة على ذلك، انعدام التحفيز المشارك بوحدات تحكم المجال Dc وإنتاج الوسطاء للالتهابات من تولدكس سواء المساهمة في تنظيم دورات تعريفية للخلايا التائية التنظيمية (تريجس) وأيضا فعالة تحول دون Th1 و Th17 التمايز وتوسيع15. في الماضي عقدين، إمكانات علاجية تولدكس أبلغت العديد من المحققين. في هذه الدراسات، ولدت تولدكس ليس فقط تحسن الأعراض المرضية في مختلف النماذج السريرية لأمراض المناعة الذاتية16 إدارة السابقين فيفو ، لكنه أدى أيضا إلى تنمية التسامح المناعي في المرضى الذين17 ،18. من المثير للاهتمام، اليوم، العلاج تولدكس نظرت كنهج بديل أو مرافقة لأمراض المناعة الذاتية في العديد من التجارب السريرية، بما في ذلك نوع 1 مرض البول السكري19،20التهاب المفاصل، 21، التصلب المتعدد (MS)22،،من2324، و مرض كرون25.
وهناك مجموعة متنوعة من البروتوكولات التي استخدمت لوضع تولدكس وأفادت مختبرات عدة أساليب لتوليد وتوصيف المظهرية من تولدكس. يمكن استخدام هذه الأساليب لتكاثر توليد تولدكس في المختبر من فروعه المكونة للدم والحفاظ على ستابلي لهم في توليروجينيك دولة في فيفو26،،من2728،29. البلدان الجزرية النامية يمكن تحويلها إلى تولدكس بالتعرض لمختلف العوامل الدوائية immunomodulatory أو السيتوكينات المضادة للالتهابات. على سبيل المثال، فيتامين D3 عامل دوائية معروفة المعروفة لزيادة إنتاج إيل-10 وقمع إفراز إيل-12 من وحدات تحكم المجال Dc ومما يعزز هذه الدالة كآبته30. وعلاوة على ذلك، عندما يتعرض DCs للمنبهات تحريضية قوية، مثل ليبوبوليساكتشاريديس (LPS)، عدة وكلاء الدوائية مثل الديكساميتازون31و32من ربمسن القشرية33 قد ثبت للحث النمط الظاهري تولدك بتخفيض DC التعبير السطحي CD40، CD80، CD86، ومهسيي34. إيل-10 و TGF-β، أظهرت السيتوكينات المضادة للالتهابات التي درست معظم للحث على التسامح العاصمة35 والتعرض ملازم لكل من هذه السيتوكينات للحث النمط الظاهري توليروجينيك في وحدات تحكم المجال Dc36.
منذ توليروجينيك DC تتحدد بالخصائص الوظيفية بدلاً من قبل علامات المظهرية، هناك كبيرة تحتاج إلى تطوير طريقة متسقة لتوصيف تولدكس الخلوية والوظيفية. وعلاوة على ذلك، يجب إنشاء بروتوكول دقيق ومتسق للتقييم متسقة ووصف النمط الظاهري توليروجينيك العاصمة إذا ما أردنا مقارنة فعالية وتكاثر عوامل جديدة قادرة على حمل النمط الظاهري تولدك في مختبر. هنا نقدم بروتوكول مفصلة خطوة بخطوة طرق لعزل البلدان الجزرية النامية من فروعه المكونة للدم في الفئران وبعد ذلك تحليل فعالية عوامل جديدة قيد التقييم لقدرتها على تحويل البلدان الجزرية النامية في تولدكس، توفير قوي توصيف وظيفي والمظهرية تولدكس في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. ويشمل هذا الوصف أسلوب وضع وصف تولدكس يغاندس السطحية وسيتوكين الشخصية، ووظائف كآبته في المختبر. كما نقدم مثالاً على طريقة لاستكشاف إمكانية تطبيق العلاج من هذه تولدكس في نموذج ما قبل سريرية لمرض التصلب العصبي المتعدد، النخاع الذاتية التجريبية (ع). هذا البروتوكول المتبعة سوف يساعد المحققين لتقييم قدرة عوامل جديدة النهوض بتحريض تولدكس وسيتم تيسير الجهود الرامية إلى توسيع نطاق التنمية العلاجية تولدك.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td>
			<td>Reata Pharmaceuticals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse GM-CSF</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>315-03</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-4</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>214-14</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>L2880</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>516732</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3097</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG (35&#8211;55) peptide</td>
			<td>21stCentury Biochemicals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 plus L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD80</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557227</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD86</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555665</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated PD-L1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124307</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated MHCII</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-112-388</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated CD11c</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340544</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-835</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-836</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423801</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan dendritic cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>A2058</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase D</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>11088858001</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin (OVA) peptide 323&#8211;329</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>O1641</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01168134_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00434165</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY419-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse EDN-1 ELISA</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>ELM-EDN1-1</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00443258</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MTA00B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00446190</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>M6000B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-23a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01160011</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-23 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY1887-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm99999154_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01288386_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01178820_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Heme Oxygenase 1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13248</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8226</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Inc.</td>
			<td></td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and functional characterization of murine tolerogenic dendritic cells

يعمل الجهاز المناعي بالحفاظ على توازن محكم بين تنسيق الاستجابات ضد المستضدات الأجنبية والحفاظ على دولة لا تستجيب ضد المستضدات الذاتية فضلا عن المستضدات المستمدة من الكائنات الحية commensal. يمكن أن يؤدي الإخلال بهذا التوازن المناعي لالتهاب مزمن وتنمية المناعة الذاتية. الخلايا الجذعية (DCs) هي خلايا نظام المناعة الفطرية المشتركة في تنشيط الخلايا السذاجة T الشروع في الاستجابات المناعية ضد المستضدات الأجنبية عرض مستضد المهنية. ومع ذلك، وحدات تحكم المجال Dc يمكن أن تكون متباينة أيضا في تولدكس التي تعمل على الحفاظ على وتعزيز التسامح خلية تي وأن قمع خلايا المستجيب المساهمة في تطوير الأوضاع الذاتية أو المزمن التهاب أما. النهوض الأخيرة في فهمنا تولدكس يوحي بأنه يمكن تحقيق التسامح DC بتحوير ظروف التمايز. أدت هذه الظاهرة إلى النمو الهائل في تطوير علاجات تولدك للاضطرابات المناعية عديدة تسبب الواجبة لكسر في منأى عن التسامح. كذلك أقرت الدراسات الناجحة في نماذج مورين المناعة الذاتية الإكلينيكية الأداة إيمونوثيرابيوتيك من تولدكس في علاج اضطرابات المناعة الذاتية. اليوم، أصبحت تولدكس أداة إيمونوثيرابيوتيك واعدة في العيادة لإعادة المفصولين التسامح المناعي في الاضطرابات المناعية المختلفة باستهداف الاستجابات الذاتية المسببة للمرض بينما ترك حصانة وقائية سليمة. على الرغم من أن مجموعة من الاستراتيجيات اقترحه مختبرات متعددة للحث على تولدكس، لا يوجد اتساق في وصف النمط الظاهري الخلوية والوظيفية لهذه الخلايا. هذا البروتوكول يوفر دليل خطوة بخطوة لتطوير وحدات تحكم المجال Dc المشتقة من نخاع العظام بإعداد كبيرة، أسلوب فريد يستخدم للتفريق بينهم في تولدكس مع triterpenoid اصطناعية 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic حمض-ديفلورو-بروبيل-أميد (كدو-مديرة)، والتقنيات المستخدمة لتأكيد على النمط الظاهري، بما في ذلك تحليلات للتوقيعات الجزيئية الأساسية من تولدكس. وأخيراً، نحن إظهار أسلوب تقييم الدالة تولدك باختبار تلك الاستجابة المثبطة للمناعة في المختبر و في فيفو في نموذج السريرية للتصلب المتعدد.

بالتمايز واختيار بمدكس:
كانت مثقف خلايا السلف نخاع العظام في إكمال المتوسطة ربمي حضور GM-CSF، وايل-4 تفرق في البلدان الجزرية النامية لمدة 7 أيام (الشكل 1A). في اليوم 1، كانت صغيرة في حجم الخلايا وأظهرت مورفولوجيا كروية. الغسيل مع برنامج تلفزيوني قبل استبدال متوسطة جديدة في يوم 3 ساعد الخلايا على شكل مجموعات، وزاد أيضا عدد سكان CD11c+ الخلايا. في يوم 4، جرى توسيع حجم بمدكس وبدأ تشكيل التكتلات. أيضا تحويل الضامة التقيد بها ولاحظ في الجزء السفلي من اللوحة بشكل مطول. في يوم 5، يتم تشكيل مجموعات كبيرة الحجم من بمدكس. في يوم 6، لوحظت أيضا عدد كبير من بمدكس شبه ملتصقة والعائمة. كانت تحصد في يوم 7 بمدكس وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي للتعبير CD11c كعلامة معينة من وحدات تحكم المجال Dc موريني. كما هو موضح في مؤامرة الخلوي تدفق ممثل في الشكل 1B، حوالي 83.6% بمدكس التعبير عن CD11c تحققت بهذا الأسلوب.
التعريف والتوصيف الوراثي من تولدكس:
بعض الوكلاء معروفة لحمل تولدكس، مثل فيتامين D338 والديكساميتازون39، معروفة لأسفل-تنظيم التعبير عن العاصمة يغاندس السطحية، بما في ذلك الثاني MHC وجزيئات كوستيمولاتوري، CD40، CD80، و CD86. على النقيض من ذلك، أظهرت مثبطات calcineurin A السيكلوسبورين و FK506 في سياق لبس أما أو النضوج الناجم عن CD40L من وحدات تحكم المجال Dc، أي تأثير على التعبير عن CD83، CD80، CD86، والثاني MHC33. كما يتبين من تحليل التدفق الخلوي، قد تقلد تولدك حسب كدو-مديرة أي تأثير كبير على التعبير يجند السطحية التي يسببها لبس من البلدان النامية، بما في ذلك CD80، CD86 والثاني MHC، PD-L1 و CD40. (الشكل 2).
وعلاوة على ذلك، التحليل المقارن الترنسكربيتوم وسيتوكين من بمدكس تعامل مع أو بدون كدو-مديرة في وجود أو عدم وجود لبس يصور الشخصية المعدلة الجينات التحريضية. العلاج كدو-مديرة انخفاضا كبيرا لبس الناجمين عن سيتوكين برو التحريضية الجينات مثل IFN-γ، إيل-12، EDN1، TNFα، وايل-6، وايل-23 (الشكل 3 ألف-3F). وهذه معروفة السيتوكينات Th1 (IFN-γ وايل-12) و Th17 (6 إيل وايل-23) تمايز الخلية. وعلاوة على ذلك، يعامل كدو-مديرة بمدكس أظهرت زيادة التعبير عن الجينات سيتوكين المضادة للالتهابات مثل إيل-4، إيل-10، TGF-β، وهو-1 (الشكل 4A-4D). تعرف هذه الجينات المضادة للالتهابات المغير المناعة الذاتية عن طريق تعزيز Th2 (إيل-4) وتمايز خلية تريغ (إيل-10 و TGF-β). 40 هنا أنه من المهم ملاحظة أن إيل-12 المميزة−؛ وإنتاج سيتوكين إيل-10+ 36واستحثاث 1 هو التعبير13وتثبيط EDN-141 الناجمة عن العلاج كدو-مديرة، وكلها المعروف أن المصادقة على وحدات تحكم المجال Dc توليروجينيك الدالة.
وصف تولدكس الخلوية والوظيفية في المختبر
انتشار DC بوساطة الخلايا T المعروف أنها ناتجة عن انخراط يجند السطحية كوستيمولاتوري فضلا عن إفراز السيتوكينات والوسطاء للذوبان7. ولكن تولدكس تمنع ردود الخلية T من خلال عدة آليات: بحمل استعطال خلية T، بنشاط على تعزيز حذف الخلايا أوتوريكتيفي وعن طريق تعزيز الاستقطاب في ساذج تي الخلايا إلى تريجس42. لقد سبق أن أبلغ توصيف وظيفي من كدو-مديرة المستحث تولدكس37. استعطال خلية تي وحذف الخلايا أوتوريكتيفي تي يمكن تحليلها بشكل مستقل عن طريق التحقق من علامات السطحية أو تلطيخ Annexin V/7-عاد. ومع ذلك، أكدنا غير مباشر هذا النمط الظاهري عن طريق قياس مؤشر انتشار الخلايا T. لهذا، تستخدم الفئران المعدلة وراثيا "أوتيي" C57BL/6 خلايا تي، ويعرضهم لوحدات تحكم المجال Dc سينجينيك المستخرجة من الفئران C57BL/6 وتعامل مع أو بدون كدو-مديرة. هذه وحدات تحكم المجال Dc تم غسلها ومثقف يشترك مع كفسي الملون خلايا تي مع الببتيد البويضات. لاحظنا انخفاض كبير في انتشار الخلايا T قبل كدو-مديرة DCs قبل المعالجة، مما يوحي النمط الظاهري توليروجينيك (الشكل 5).
في فيفو توصيف وظيفي تولدكس في نموذج الإكلينيكية للمناعة الذاتية
أخيرا، يمكن اختبار الأداء الوظيفي لتولدكس الناجمة عن مديرة في أي عدد من السريري في فيفو نماذج تتسم المناعة الذاتية أو تحريضية الميزات. منذ ذلك الحين، إي نموذج موريني الإكلينيكية مقبولة على نطاق واسع من الأمراض السريرية المناعية بوساطة الجهاز العصبي المركزي، مرض التصلب العصبي المتعدد43، يمكننا استخدام هذا في دراستنا الحالية. وبغية مواصلة النظر في فيفو الناجم عن وظيفة مديرة كدو تولدكس، وطالبنا منهم في نموذج مورين الإكلينيكية من ع السلبي. لهذا، كان مثقف بمدكس مع أو بدون كدو-مديرة في وجود لبس وموج (35-55). ثم تم حقن هذه الخلايا مرارا وتكرارا كبروتوكول المجدولة التي صورت في الشكل 6A والفئران لوحظت بشكل روتيني للمجاهرة بعلامات سريرية. كما هو متوقع، لبس وموج (35-55) نابض بمدكس أعراض سريرية من إي، ومع ذلك؛ كدو-مديرة معبي بمدكس تعامل المجموعة أظهرت تأخر ظهور المرض مع انخفاض ملحوظ الأعراض السريرية (الشكل 6B). هذه النتائج التحقق من صحة النمط الظاهري كآبته من تولدكس الناجمة عن العلاج كدو-مديرة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig1.jpg"> رقم 1: التنمية وتحديد خصائصها المظهرية بمدكس: (A) يخرجوا من عظام الساق والفخذ من الفئران C57BL/6 خلايا النخاع العظمى وكذلك متباينة إلى بمدكس. وكان تتبعها تشكيل كتلة خلية مناسبة الخفيفة الميكروسكوب خلال كامل فترة التمايز (مقياس الحانات، 100µm). (ب) التمايز بمدكس أكد التعبير السطحي CD11c، كما تحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. تصوير الرسوم البيانية نسبة CD11c الموسعة+ خلية السكان. كانت بوابات استراتيجية (ج) جاتينج بمدكس-الخلايا أولاً لاستبعاد الحطام (FSC مقابل SSC). واستخدم بوابة إقصاء يبنوا للبوابة على نوع الخلايا (FL2 W مقابل FL2-A). داخل خلايا القميص، كانت بوابات الخلايا الحية على الأرض 7-عاد (عاد 7 مقابل منتدى التعاون الأمني). ثم كذلك تحليل الخلايا وبوابات في التعبير CD11c. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig2.jpg"> رقم 2: هو دون تغيير التعبير السطحي يجند خلية العاصمة قبل كدو-مديرة- كانت الخلايا ما قبل المعالجة في وجود أو عدم وجود كدو-مديرة (200 nM) لمدة ساعة واحدة قبل التحفيز مع لبس (100 نانوغرام/ملليلتر) ل 24 ساعة. وقد تم تحليل التعبير سطح الخلية CD80، CD86، والثاني MHC، PD-L1 و CD40 بالتدفق الخلوي. وقد تم تعديل هذا الرقم من التقارير العلمية 7، المادة رقم: 9886 (2017)، doi:10.1038/s41598-017-06907-4. المستنسخة ونشرها مع إذن حقوق التأليف والنشر. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig3.jpg"> الشكل 3: كدو-مديرة تغيير النمط الظاهري الوراثية والبروتين من مكسبه DCs. بمدكس يعاملون مسبقاً في وجود أو عدم وجود كدو-مديرة (50-400 نانومتر) لمدة ساعة واحدة قبل إضافة للبس (100 نانوغرام/مل)، وأما المقطوع لاستخراج الحمض النووي الريبي (4 ساعة). أو السماح بشرط الثقافة المتوسطة ل 24 ساعة. قبل جمع لتحليلات سيتوكين. تم قياس مستويات إيل-12 (ب)، TNFα (د)، وايل-6 (ه)، وايل-23 (و) قرة-بكر وإليزا. وفي حين تم قياس مستوى IFN-γ (A) بكر قرة و EDN-1 (C) من أليسا وحدها. يتم التعبير عن النتائج يعني ± التنمية المستدامة من ثلاث تجارب. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001 بالمقارنة مع المجموعات المعالجة بلبس. اختبار t مزاوج الطالب. وقد تم تعديل هذا الرقم من التقارير العلمية 7، المادة رقم: 9886 (2017)، doi:10.1038/s41598-017-06907-4. المستنسخة ونشرها مع إذن حقوق التأليف والنشر ". <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig4.jpg"> الشكل 4: كدو-مديرة الناجم عن النمط الظاهري تولدكس أكده تعبير الجينات والبروتين. بمدكس كانت مرحلة ما قبل المعالجة في وجود أو عدم وجود كدو-مديرة (10-400 نانومتر) لمدة ساعة واحدة قبل إضافة للبس (100 نانوغرام/مل)، والتي كانت تحصد الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي بعد 24 ساعة. تم قياس مستويات إيل-4 (A)، وايل-10 (ب)، و TGF-β (C) ببكر قرت. (د) الخلية البروتين ليساتيس جمعت في 12 ساعة. للتحاليل والمستويات هو 1، و β-أكتين تحددها التعبير النشاف الغربية. يتم التعبير عن النتائج يعني ± التنمية المستدامة من ثلاث تجارب. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001 بالمقارنة مع المجموعات المعالجة بلبس. اختبار t مزاوج الطالب. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig5.jpg"> الرقم 5: كدو-مديرة تعرض وحدات تحكم المجال Dc قمع انتشار الخلايا تي- كانت وحدات تحكم المجال Dc قبل المعالجة مع كدو-مديرة (100-400 نانومتر) لمدة ساعة واحدة فقط، ثم الملون كفسي غسلها ومثقف يشترك مع خلايا تي في 01:10 نسبة. (أ) الطحال الخلايا T ووحدات تحكم المجال Dc كانت معزولة من الفئران المعدلة وراثيا "أوتي" C57BL/6 والفئران C57BL/6، على التوالي. كدو-مديرة pretreated وحدات تحكم المجال Dc قد شارك مثقف مع كفسي الملون الخلايا T مع (ث) أو بدون (ث/س) إضافة البويضات أثناء الحضانة. تكاثر الخلايا t تحددها التدفق الخلوي في اليوم الثاني. رسومات تصور النسبة المئوية لتقسيم الخلايا T بالنسبة لأرقام انقسام الخلايا T. البيانات عبارة عن تمثيل للتجارب المستقلة 3. وقد تم تعديل هذا الرقم من التقارير العلمية 7، المادة رقم: 9886 (2017)، doi:10.1038/s41598-017-06907-4. المستنسخة ونشرها مع إذن حقوق التأليف والنشر. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig6.jpg"> رقم 6: موج معبي السلبي الناجم عن العاصمة هو إلغاؤها ع طريق تولدكس- (A) إي التعريفي بموج (35-55)-نابض بمدكس. بمدكس ناضجة يعاملون في وجود أو عدم وجود كدو-مديرة (400 نانومتر) ونابض في وقت لاحق مع موج (35-55) 4 ساعات. إجمالي 200 ميكروليتر من 2 × 106 خلايا تدار عن طريق الحقن تحت الجلد في منطقة الجناح للفئران C57BL/6 مرة واحدة كل أسبوع لما مجموعة أربع حقن. في كل مرة، كان يدير PTX حقن القائمة فورا ومرة أخرى 2 بعد أيام (يوم 0 في الدورة الرابعة). (ب) السريرية كانت مسجل الحقن بعد كل أربع، باستخدام المعايير القياسية. وقدمت جميع البيانات ك ± يعني S.E.M. * P < 0.05. T-اختبارات متعددة مع تحليل صداق هولم (n = 7 الفئران في كل مجموعة). وقد تم تعديل هذا الرقم من التقارير العلمية 7، المادة رقم: 9886 (2017)، doi:10.1038/s41598-017-06907-4. المستنسخة ونشرها مع إذن حقوق التأليف والنشر. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتطوير وتميز الخلايا الجذعية توليروجينيك (تولدكس) وتقييم فائدتها إيمونوثيرابيوتيك.

التنمية وتوصيف وظيفي للخلايا الجذعية مورين توليروجينيك

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

development-functional-characterization-murine-tolerogenic-dendritic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K Views.  Case Western Reserve University. نقدم هنا، وضع بروتوكول لتطوير وتميز الخلايا الجذعية توليروجينيك (تولدكس) وتقييم فائدتها إيمونوثيرابيوتيك.

Video: Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

تجزئة والقياس من وحدات تخزين الدهون في الفئران نماذج السمنة عن طريق الأشعة السينية التصوير المقطعي

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and standardized not only for the study of allo-rejection but also between syngeneic strains for examining mechanisms of ischemia-reperfusion injury after lung transplantation. Although the application of the rat and other large animal model 2 contributed significantly to the elucidation of these studies, the scope of those investigations is limited by the scarcity of knockout and transgenic rats. Due to no effective therapies for obliterative bronchiolitis, the leading cause of death in lung transplant patients, there has been an intensive search for pre-clinical models that replicate obliterative bronchiolitis. The tracheal allograft model is the most widely used and may reproduce some of the histopathologic features of obliterative bronchiolitis 3. However, the lack of an intact vasculature with no connection to the recipient's conducting airways, and incomplete pathologic features of obliterative bronchiolitis limit the utility of this model 4. Unlike transplantation of other solid organs, vascularized mouse lung transplants have only recently been reported by Okazaki and colleagues for the first time in 2007 5. Applying the basic principles of the rat lung transplant, our lab initiated the obliterative bronchiolitis model using minor histoincompatible antigen murine orthotopic single-left lung transplants which allows the further study of obliterative bronchiolitis immunopathogenesis6.

Obliterative bronchiolitis is the key impediment to the long-term survival of lung transplant recipients and the lack of a robust preclinical model precludes examining obliterative bronchiolitis immunopathogenesis. Unlike other solid organ transplants, vascularized mouse lung transplantation has only recently been developed. Here we show our independently developed obliterative bronchiolitis model after murine orthotopic single-lung transplantation.

تطوير النزلات الشعبية مسد في نموذج الفئران من زرع الرئة Orthotopic

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133<sup&gt; +</sup&gt; خلايا الجذعية السرطانية المزعومين من الميلانوما

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

تقييم سرطان المبيض كروي مرفق وغزو الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

عالية الإنتاجية توصيف الخلايا الجذعية البالغة المهندسة لتسليم العوامل العلاجية لاستراتيجيات اعصاب

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

في المختبر توصيف الوظيفي للماوس القولون والمستقيم وارد النهايات

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; توصيف ممغنط مير تعديل الخلايا البطانية

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...