الكتاب يود أن يشكر غريغوري هالر (جبل سانت فنسنت جامعة) لعمله الأولى في تطوير البروتوكول. أيضا يود المؤلفون أن يشكر نيكولاس جونز (جبل جامعة سانت فنسنت) للخبرة الفنية والمساعدة بتصوير وإنتاج الجزء السمعية والبصرية من المخطوطة. دانيال أندروز كانت مدعومة بتمويل من مسفو والعلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة) عبر "تحكيم البحوث الطلابية الجامعية". تمارا ألف فرانز-أوديندال معتمد من قبل "منحة اكتشاف الأموال".

ملاحظة: لمراحل الجنين، والاستفادة من همبرغر وهاملتون12 (ح ح) تنظيم الجدول.
1-الجنين الحضانة
<ol><li>احتضان بيض الدجاج المخصب في حاضنة العقيمة، ودرجة الحرارة التي تسيطر على 37 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية و ~ 40% رطوبة.</li>
	<li>تشغيل البيض 1 x يوميا والسماح لهم باحتضانها ل HH34 (التسميد بعد 8 أيام).</li>
</ol>2-الإعداد والتعقيم المواد
<ol><li>للأجنة 12، اﻷوتوكﻻف 2 لتر ماء المقطر، L 1 الملحية الفرخ 0.85 في المائة، 12 الزجاج الماصات، مربع 1 ورقة والأنسجة والساحات 24 سم 2.5 x 2.5 سم من ورق الترشيح شبه مسامية والساحات 24 سم 2.5 x 2.5 سم من أسلاك الفولاذ مش مع حواف منحنية إلى أسفل. لتعقيم المواد، اﻷوتوكﻻف لهم في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. ملاحظة: يمكن أن يتم التعقيم المواد في وقت مبكر.</li>
	<li>تعقيم الحاضنة مع الإيثانول 70% بالمسح الجانبين ورفوف وباب. 2 مكان حاويات بلاستيكية تحتوي على يعقم المقطر المياه داخل الحاضنة للحفاظ على رطوبة. بريوارم حاضنة الثقافة إلى 37 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية و ~ 40% رطوبة. ضمان الحاضنة مظلمة تماما؛ إذا كان الباب شفاف، تغطي بورق ألمونيوم.</li>
	<li>بريوارم 100 مل من المغذيات المتوسطة و 1 مل من البنسلين بوضعها في حاضنة الثقافة.</li>
	<li>وتغطي مساحة العمل مع منشفة ورقية وتعقيم على مقاعد البدلاء برش عليه مع الإيثانول 70%. تعقيم 2 زوجاً من ملقط ومقص التشريح وشفرة حلاقة وملعقة بلاستيكية مع الإيثانول 70% بطريقة مماثلة.</li>
	<li>أطباق بتري معقمة 100 مم 12 مكان وأطباق بيتري معقمة 35 ملم 24 على مقاعد البدلاء للاستخدام. ضمان الأطباق تظل في كيس معقم حتى الاستخدام.</li>
</ol>3-الجنين إعداد
ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، ارتداء قناع لوجه غبار واقية لتجنب تلويث الثقافات. سوف تدمر عدوى البكتيرية أو الفطرية الثقافة، وهناك خطر لأنه ينتشر بسرعة إلى جميع الثقافات في الحاضنة.
<ol><li>الكراك فتح البيضة ونقل الجنين إلى طبق بتري 100 ملم التي تحتوي على المحلول الملحي الفرخ 0.85 في المائة. مرحلة الجنين وفقا للميزات التشريحية الموصوف في همبرغر وهاملتون التدريج المبادئ التوجيهية12 والتأكد من الجنين في HH34.</li>
	<li>قطع الرقبة وثم تقسم رأس الجنين في خط الوسط باستخدام شفرة حلاقة معقم. استخدام الملقط العقيمة، إزالة الدماغ. ترك المنقار سليمة.</li>
</ol>4-الثقافة الإعداد
<ol><li>2 مكان من أطباق بتري 35 مم داخل طبق بيتري 100 مليمتر واحد.</li>
	<li>وضع شبكة أسلاك الفولاذ داخل كل طبق بتري 35 ملم.</li>
	<li>استخدام الملقط، نقل 1 الرؤساء منطقتي بقطعة من ورق الترشيح شبه مسامية 2.5 × 2.5 سم بالعين مواجهة. ضمان الأنسجة آمنة ولا تنزلق قبالة عن إمالة فإنه قليلاً.</li>
	<li>استخدام الملقط، بعناية وضع نسيج العين وورق الترشيح على رأس شبكة أسلاك الفولاذ في 1 أطباق بتري 35 مم، خلق مرحلة أثيرت مع نسيج العين على أعلى.</li>
	<li>كرر الخطوات من 4، 3 و 4-4 مع نصف الرأس الأخرى.</li>
	<li>استخدام ماصة زجاجية معقمة، بعناية إضافة المتوسطة المغذيات مباشرة في كل طبق بتري 35 مم حتى يصل إلى مستوى الورقة عامل التصفية. لا تغرق نصف رأس في الأجلين المتوسط والمغذيات.</li>
	<li>إضافة 50 ميليلتر من 10,000 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين المتوسطة المغذيات في كل طبق بيتري.</li>
	<li>اطوِ قطعة من المناديل الورقية في مربع صغير ووضعه داخل مم 100 طبق بيتري. ترطيب أنه مع الماء المقطر يعقم.</li>
	<li>ضع الطبق الثقافة إلى حاضنة العقيمة، والظلام في 37 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية و ~ 40% رطوبة لمدة تصل إلى 4 أيام.</li>
	<li>كرر الخطوتين 3 و 4 لكل جنين. ملاحظة: عدد الأجنة اللازمة سوف تعتمد على التجربة محددة؛ هنا، يمكننا وصف البروتوكول للأجنة 12.</li>
</ol>5-ثقافة الصيانة
<ol><li>مرة واحدة يوميا، أعلى في حاويات بلاستيكية في الحاضنة مع الماء المقطر الطازجة، ويعقم.</li>
	<li>يوميا تحقق جميع الثقافات للعدوى البكتيرية أو الفطرية. الثقافات التي قد تفككت أو التي تغيرت المتوسط لون مصابون. تجاهل جميع الثقافات التي هي المصابة.</li>
</ol>6-التثبيت
<ol><li>بعد استزراع، إزالة جميع الأطباق من الحاضنة.</li>
	<li>برفق باستخدام زوج من الملقط، إزالة العين من ورق الترشيح، مع الحرص على عدم تمزيق النسيج.</li>
	<li>إصلاح نسيج العين في بارافورمالدهيد 4% 1 × مخزنة الفوسفات المالحة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو الفورمالين 10% مخزنة محايدة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تخزين الأنسجة في 4 درجات مئوية في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+the+development+of+scleral+ossicles+in+the+chicken,+Gallus+gallus.">Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus.</a> Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).</li><li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+motor+proteins+in+echinoderm+embryos:+an+argument+in+support+of+antibody+inhibition+experiments.">Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).</li><li>Horakova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+FGFR+inhibitors+on+chicken+limb+development.">Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).</li><li>Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbead+Implantation+in+the+Zebrafish+Embryo.">Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).</li><li>Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Embryonic+Chick+Eyes.">Electroporation of Embryonic Chick Eyes.</a> Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).</li><li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+organ+culture+of+embryonic+chick+femora:+a+system+for+investigating+bone+and+cartilage+formation+at+an+intermediate+level+of+organization.">Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).</li><li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+inhibitory+action+of+BMPs+and+their+relationships+with+activators+in+feather+formation:+implications+for+periodic+patterning.">Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning.</a> Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).</li><li>McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+functions+by+localizing+the+region+of+proliferation+in+early+developing+feather+buds.">Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds.</a> Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).</li><li>Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+take+on+an+old+story:+chick+limb+organ+culture+for+skeletal+niche+development+and+regenerative+medicine+evaluation.">A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation.</a> European Cells &amp; Materials. 26, 91-106 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Spermatogenesis+in+Explanted+Adult+Mouse+Testis+Tissues.">In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues.</a> PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).</li><li>Ochoa-Villarreal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+culture+strategies+for+the+production+of+natural+products.">Plant cell culture strategies for the production of natural products.</a> BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+biology+of+feather+follicles.">The developmental biology of feather follicles.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48, 181-191 (2004).</li><li>Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+cellular+dynamics+during+the+development+of+intramembranous+bones:+the+scleral+ossicles.">An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles.</a> Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Pinto, C. B., Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+understanding+of+the+epithelial+requirement+for+osteogenesis+in+scleral+mesenchyme+of+the+embryonic+chick.">Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick.</a> Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).</li><li>Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia.">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).</li><li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development.">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

هذا البروتوكول يجعل استخدام أنسجة المنشأة استزراع تقنيات لتحقيق نمو العين الدجاج من الجنينية يوم 8 (HH34) في المختبر لمدة 4 أيام. ووصف هذا الأسلوب استزراع الشبكة أصلاً تروويل15. نحن الأمثل بروتوكولا من بينتو وقاعة لعام 1991 دراسة16 استخدام غشاء شبه مسامية مع الشبكة لدراسة الإشارات الاستقرائي بين طبقات الأنسجة المنفصلة من العين الدجاج الجنينية15. باستخدام هذا الأسلوب، صرصور مثقف عظم الدجاج 14-القديمة يوم6. كما أثبت هذا الأسلوب الفعال في استزراع الأنسجة الماوس6،17. استخدام ورق الترشيح أمر حاسم لنجاح البروتوكول أنها تساعد الأنسجة تناول المغذيات من المتوسطة فعالية دون تشبع أو سوبميرسينج الأنسجة.
المتوسطة المغذيات في الرقم الهيدروجيني سليم أمر بالغ الأهمية للنمو الأمثل. ينبغي أن يكون المتوسط في أو بالقرب من الرقم الهيدروجيني الفسيولوجي، واستخدام الفينول الحمراء في المتوسط مؤشرا على توفر ميزة في أن التغييرات الأس الهيدروجيني يمكن الكشف عنها بسهولة. يمكن استخدام وسائل الإعلام الحرة المصل، وتغيير وسائل الإعلام يوميا ليس ضروريا ولا يؤثر على النتائج. البروتوكول تم تطويرها باستخدام وسيلة متاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد)، الذي يحتوي على مستويات عالية من الأحماض الأمينية والجلوكوز؛ هناك حاجة إلى لا مكملات أخرى من وسائل الإعلام. معظم الحوادث لنمو الأنسجة سوء استخدام هذا البروتوكول وقع عندما وسائط الإعلام المغذيات أما على درجة حموضة غير لائق أو الملوثة.
العين يمكن البقاء على قيد الحياة وتنمو لتصل إلى 4 أيام في المختبر، بدءاً من اليوم الجنينية 8, عندما يتم تنفيذ البروتوكول تحت الظروف المثلى. واحد الحد من هذا البروتوكول أنه تأثر البقاء على قيد الحياة بعد 4 أيام من استزراع. وهكذا، سوف تتطلب العمليات التنموية التي تمتد على فترة زمنية أطول التعديلات على البروتوكول. قيد آخر من البروتوكول هو عدم وجود تدفق الدم النشطة، والأوعية الدموية. الأوعية الدموية هامة لكثير من العمليات التنموية، ليس فقط لإيصال المواد الغذائية إلى أنسجة9، وهو يتحقق في المختبر عن طريق عمل الشعرية عن طريق تصفية الورق التي يرتكز عليها الأنسجة.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة تطوير الأجهزة كلها أو أجزاء كبيرة من الأنسجة في المختبر. فقاريات أجهزة معقدة للغاية، وتنميتها وينظم العديد من الأنماط الزمانية المكانية المتميزة. دراسة هذه المسارات الإنمائية يعتمد على القدرة على التعامل مع الإشارات التي تنظم لهم. الأساليب الحالية تحد من هذا التلاعب على مناطق صغيرة نسبيا، والمترجمة، وتركيزات منخفضة بما يكفي لتجنب فتك جنينية. على سبيل المثال، تقتصر الطريقة ex ovo استزراع الجنين الدجاج كامل في الثقافة18 أو الأسلوب إلى نافذة البيض19 القيام بالتلاعب في ذلك أما الجنين أكمله يجب أن يعامل، الذي يمكن أن يسبب الفتك، أو فقط يتم التعامل مع منطقة محلية صغيرة. وميزة البروتوكول المعروضة هنا أنه يمكن دراسة أثر هذه الإشارات على الأجهزة كلها أو كميات كبيرة من الأنسجة، دون التأثير على استمرارية الجنينية. لا يتطلب هذا البروتوكول أي مكملات مع ثاني أكسيد الكربون كما هو الحال في وقت سابق البروتوكولات15. التأخير في التنمية التي يمكننا ملاحظتها ميزة في أنه يمكن دراسة عمليات التنمية السريعة.

الدجاج الجنينية (Gallus gallus) كائن حي نموذجية ممتازة استخداماً في مجال البيولوجيا. فترة حضانة المرض ما يقرب من 21 يوما، ويمكن المحتضنة الكثير من البيض في وقت واحد، مما يجعل تجربة سريعة وفعالة. ولعل الأهم من ذلك، الجنين هو أيضا بسهولة التلاعب بها، تمكن الدراسة المستفيضة للعمليات الإنمائية الرئيسية والجينات والبروتينات التي تدفع هذه العمليات.
العين الدجاج الجنينية هو جهاز معقدة التي تنشأ عن طريق التفاعل بين عدد من أنسجة مختلفة مشابهة للعديد من أجهزة الجسم الأخرى. هذا الأسلوب يتيح لدراسة وضع هذه الأنسجة، ولا سيما في مراحل متقدمة من التنمية. على سبيل المثال، قد تكون الشبكية متعددة الطبقات ذات أهمية خاصة لأولئك الذين يدرسون تطوير النظام العصبي. الأساليب البديلة التي تمكن من دراسة أنسجة العين الأخرى كالقرنية والجسم فيتريل، العدسة، والصلبة العينية والجفون ذات فائدة للباحثين. العين الدجاج الجنينية يحتوي أيضا على سلسلة من العظام المسطحة، والعظيمات scleral، التي يمكن استخدامها كنموذج لدراسة تعريفية العظام إينتراميمبرانوس والتحجر في الفقاريات1.
حاليا، هناك عدد من الأساليب المستخدمة لدراسة التطور الجنيني. ميكروينجيكشنز الأجسام المضادة المثبطة أو غيرها الجزيئات المثبطة2،3، مزروع جراحيا ميكروبيدس غارقة في المانع4، وهي انهانسر5 كافة الأساليب التي يمكن استخدامها للجينات دوونريجولاتي أو البروتينات للاهتمام بجنين. وتستخدم أساليب مماثلة للبروتينات أوبريجولاتي. هذه الطرق لا تخلو من أوجه القصور. على سبيل المثال، عند استخدام المواد الكيميائية لتغيير وضع الجنين، يجب تقييم آثار قاتلة على الجنين، وهذا يحد من استخدام الأساليب المذكورة أعلاه للمواقع المترجمة للتطبيق عند التعرض لجرعات منخفضة بما يكفي لضمان استمرارية الجنين.
في المختبر استزراع الأنسجة قد استخدمت في طائفة واسعة من الكائنات الحية لدراسة التنمية ويمكن استخدامها لتجاوز بعض القيود المذكورة أعلاه. على سبيل المثال، فيمورى6وريشة براعم7،8، و أطرافه9 من الدجاج كل درست باستخدام أساليب، استزراع الأنسجة الخصيتين الماوس10 والجذور وينبع من النباتات11. تمنح هذه الأساليب العلماء بدرجة عالية من التحكم في تنمية الأنسجة، مثل القدرة على التقلب في درجة الحرارة وتغير توافر المغذيات. عزل الأنسجة من الجنين كله أيضا يجعلها أقل عرضه للآثار المميتة للمواد الكيميائية، مما يمكن التلاعب بدراسات على نطاق عالمي في تركيزات أعلى. هناك ميزة أخرى بارزة في المختبر استزراع هو الحفاظ على البيئة في الأنسجة الخلوية؛ ترتيب الأنسجة يظل دون تغيير نسبيا، مما يجعل من الممكن دراسة التفاعلات بين أنواع مختلفة من الأنسجة9. وهكذا، في المختبر استزراع يفتح الأبواب أمام إضافية تجريبية النهج غير متوفرة في النماذج في فيفو أو في ovo .
دراسة تطوير العين الدجاج الجنينية باستخدام المواد الكيميائية حاليا تحديا كبيرا. تغطية عدد من الأغشية اكسترامبريونيك الجنين، مما يجعل من الصعب على تطبيق ميكروبيدس أو المواد الكيميائية؛ الجنين أيضا جداً نشطة داخل البيضة كما يحصل كبار السن، مما زاد من تعقيد أسلوب صعبة بالفعل. هذا البروتوكول يتيح سهولة الوصول إلى العين والأنسجة المحيطة بها، إزالة هذه الحواجز، بينما توفر أيضا فرصاً جديدة دراسة العمليات الإنمائية داخل العين. تم إنشاء هذا البروتوكول لدراسة تنظيم دورات تعريفية العظيمات scleral داخل العين الجنينية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1082">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm cell culture petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td style="width:676px;">easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 mm cell culture petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td>tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paper tissue</td>
			<td style="width:71px;">Kimtech</td>
			<td style="width:119px;">34155</td>
			<td>Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">wire mesh</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">disposable glass pipettes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-010</td>
			<td>Borosilicate glass disposable 5 3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">nutrient medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12591-038</td>
			<td>Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4458</td>
			<td>10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">1454 090</td>
			<td>semi-porous filter paper 90mm</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">fertilized chicken eggs</td>
			<td style="width:71px;">Dalhousie University Agricultural College</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>can be obtained from local farms</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:71px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0420-3</td>
			<td>sodium chloride crystals, reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 L glass bottle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89000-240</td>
			<td>1 L pyrex autoclavable glass bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP82011</td>
			<td>70% molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tupperware containers</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>store-bought and sterilized with EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">disposable razor blades</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">55411-050</td>
			<td>single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">plastic spoons</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>store-bought and sterilized with EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dust mask</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>3M 8500 Comfort Mask</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>paraformaldehyde, reagent grade, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">neutral-buffered formalin</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">72210</td>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml falcon tubes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td>presterilized centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>fine forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">chick saline&#160;</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a&#160;</td>
			<td>0.85% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tinfoil</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>store-bought</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paper towel</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>store-bought</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic culture method to study the development of embryonic chicken tissues

الدجاج الجنينية يستخدم عادة ككائن نموذج موثوق بها للتنمية الفقاريات. إمكانية الوصول وحضانة قصيرة الفترة يجعلها مثالية للتجريب. حاليا، تجري دراسة هذه المسارات الإنمائية في الجنين الدجاج بتطبيق مثبطات والمخدرات في مواقع محلية وتركيزات منخفضة باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب. استزراع الأنسجة في المختبر هو أسلوب الذي يتيح دراسة الأنسجة فصلها عن الكائن الحي المضيف، بينما في الوقت نفسه تجاوز العديد من القيود المادية الحالية عند العمل مع الأجنة كله، مثل قابلية الأجنة إلى جرعات عالية من المواد الكيميائية يمكن أن تكون مميتة. نقدم هنا، أورجانوتيبيك استزراع البروتوكول لاستزراع الدجاج الجنينية نصف الرأس في المختبر، مما يتيح فرصاً جديدة للنظر في العمليات الإنمائية وراء الأساليب المتبعة حاليا.

باستخدام هذا الأسلوب، يمكن مثقف عين دجاج جنينية من يوم 8 من تطورها (HH34) في المختبر لمدة 4 أيام. أربعة أيام في ovo التنمية يناظر HH38.
ويدعم هذا الأسلوب تثقيف وضع براعم ريشة المحيطة بالعين والجفون (الشكل 1B). لا تكون هذه البراعم ريشة الحالية في ovo في HH34 قبل استزراع (الشكل 1A)، مما يشير إلى أن تبدأ التنمية برعم ريشة أثناء فترة تثقيف، كما هو في ovo13 (الشكل 1). تنمو على الجفون وغشاء نيكتيتاتينج لتغطية العين خلال تثقيف (الشكل 1B). تظهر الجفون أكثر نضجاً بعد في المختبر استزراع من بداية استزراع في HH34 (الشكل 1A) لكنها أقل تطورا من HH38 (الشكل 1). وتبين هذه البيانات أن يتم دعم الجوانب الرئيسية من التنمية الجنينية، لكن مع بعض التأخير الصغيرة.
بعد استزراع، نحن تشريح الجزء الأمامي من العين لإظهار نتوءات مايوجد (عصابة عابرة لنتوءات الظهارية 13-14)، الذي يعمل معلما آخر حتى الآن تشير إلى أن الأحداث التنموية معتمدة في الثقافة. عادة، يتم تشكيلها هذه الحليمات تماما من قبل HH34 (الشكل 1)، وتتدهور مع مرور الوقت كما أنها تحفز كوندينسيشنز سكيليتوجينيك في ميسينتشيمي الأساسية؛ أنها تختفي من HH381 (الشكل 1F). البيانات المتوفرة لدينا تظهر أن هذا الانحطاط يحدث في المختبر (الشكل 1E) مسبوقة تسطيح الحليمات اتباع نمط التنمية في ovo . أونستينيد كوندينسيشنز، ومع ذلك، لا تظهر في العينات في المختبر ، على خلاف في HH38 (الشكل 1F). كنا الفوسفاتيز القلوية تلطيخ، الذي يكشف عن النشاط osteoblast المبكر مواصلة تقييم التعريفي لهذه كوندينسيشنز14؛ تحدث هذه العملية جنبا إلى جنب مع انحطاط الحليمات مايوجد في ovo. تنصيب كوندينسيشنز سكيليتوجينيك، الذي يبدأ في HH34 (الشكل 1)، الشروع في المختبر كما يتضح من الفوسفاتيز القلوية تلطيخ (ح الشكل 1). هذه كوندينساتيونس، ومع ذلك، ليس بوصفه كبير كما في HH3814 (الرقم 1I)، مرة أخرى تشير إلى أن هناك تأخير صغير في التنمية. أننا نقدر أن 4 أيام لاستزراع تمثل حوالي 2 يوما تنمية الجنينية؛ ومن ثم تأخير من حوالي 50%. تظهر هذه النتائج أن الاستقراء وتنمية العظام إينتراميمبرانوس، كوندينسيشنز سكليرال، هو جماعياً، معتمدة في المختبر ، وأن العمليات الإنمائية مثل النمو جفن وتشكيل برعم الريش المضي قدما في المختبر.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57619/57619fig1.jpg"> الشكل 1 . الخصائص المورفولوجية ل في المختبر مثقف عيون وعيون HH34 عيون HH38- أ - و أونستينيد G -- أنا ملطخة لأنزيم الفوسفاتيز القلوي (AP) لتمييز خلايا الاوستيوبلاستس النشطة داخل كوندينسيشنز سكليرال. أ ود وز إظهار العينين في بداية فترة تثقيف في HH34. بو Eو H إظهار العينين بعد 4 أيام من استزراع في المختبر . ج، و، و إظهار العينين بعد 4 أيام في ovo استزراع، في HH38. وينظر إلى كل العيون أفقياً. الحليمات (A) مايوجد مرئية في عصابة المحيطة بالقرنية. تشير العلامة نجمية إلى الحليمة #12، أول واحد إلى النموذج. يشير السهم إلى حافة الجفن في منطقة الآنف للعين. (ب) قد سويت بالأرض الحليمات مايوجد وبدأت تتدهور. يشير السهم إلى برعم ريشة متنامية. (ج) مايوجد الحليمات قد تحولت تماما ومشمولة بالجفون وغشاء نيكتيتاتينج. يشير السهم مفتوحة إلى حافة الجفن في منطقة الآنف للعين. يشير السهم الصلبة إلى برعم ريشة متنامية. (د) تشريح الجزء الأمامي من العين HH34. تشير العلامة النجمية إلى الحليمة #12. (ﻫ) تشريح الجزء الأمامي من HH34 + 4 في المختبر العين تظهر نتوءات الأرض. نتوءات في المنطقة الزمنية (سهم خالص) وبدأت تتدهور؛ هذه هي نتوءات أقدم في الحلقة. (و) جزء الأمامي تشريح العين HH38 مع الجفون والأغشية نيكتيتاتينج إزالتها، تبين أن جميع نتوءات قد تدهورت. خطوط متقطعة مخطط موقف اثنين كوندينسيشنز أونستينيد المجاورة. HH34 A (ز) العين الملون لوكالة اسوشييتد برس عرض كوندينساتيونس سكيليتوجينيك صغيرة جداً يدل على بدء التعريفي. (ح) HH34 A + 4 العين الملون لوكالة اسوشييتد برس عرض الموسع، ينمو كوندينسيشنز سكيليتوجينيك. (أنا) HH38 بالعين الملون لوكالة اسوشييتد برس عرض كوندينسيشنز سكيليتوجينيك كبيرة. هي كافة أشرطة مقياس 1 مم. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57619/57619fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues at JoVE.com

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

أسلوب الثقافة أورجانوتيبيك لدراسة تطوير الأنسجة الجنينية الدجاج

نقدم هنا، أورجانوتيبيك استزراع البروتوكول لتنمو الأجهزة الدجاج الجنينية في المختبر. باستخدام هذا الأسلوب، تنمية الأنسجة الجنينية الدجاج يمكن دراستها، مع الحفاظ على درجة عالية من السيطرة على البيئة الثقافة.

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

organotypic-culture-method-to-study-development-embryonic-chicken

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K Views.  Mount Saint Vincent University. نقدم هنا، أورجانوتيبيك استزراع البروتوكول لتنمو الأجهزة الدجاج الجنينية في المختبر. باستخدام هذا الأسلوب، تنمية الأنسجة الجنينية الدجاج يمكن دراستها، مع الحفاظ على درجة عالية من السيطرة على البيئة الثقافة.

Video: Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

تنظيم جينية من القلب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

رواية<em&gt; البيضة السابقين</em&gt; التطويق وتقنيات لتغيير داخل القلب ديناميكا الدم في نظام الجنينية الدجاج

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

ثقافة الفئران الجنينية الأمشاط: نموذج الفسيولوجي من غضروفي التعظم

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

عزل الأنسجة الجنينية وتشكيل أجهزة تشيميريك السمان-الدجاج باستخدام المثال الغدة الصعترية

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.