المؤلف يود أن يشكر إريك فيشباك (جامعة دي موين، دي موين، آيوا، الولايات المتحدة الأمريكية) لمساعدته مع إطلاق النار وتحرير الفيديو. وقدم الدكتور مارك دونوويتز (جامعة جونز هوبكنز مدرسة الطب، بالتيمور، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية) يرجى الخلايا تنتجها الخلايا الليفية مثل PS120 ستابلي يعبر عن وزن NHE3 أو NHE3-يرك.

ملاحظة: اثنين من مكبرات الصوت مطلوبة لتسجيل نشاط الناقلين اليكترونيوترال ببورصة اسطنبول ذات مرجعية ذاتية بالاقتران مع التصحيح لقط، مكبر للصوت المشبك تصحيح للحفاظ على الخلية الموجودة في تكوين كل خلية و (مكبر للصوت عالية إيمبيندينسي الكترومتر) لتسجيل نشاط الناقل عبر بورصة اسطنبول (انظر الجدول للمواد). مكبر للصوت المشبك التصحيح متصل مباشرة إلى المجلس اقتناء محطة طرفية. الكترومتر متصل بمكبر للصوت التفاضلية المستخدمة لتصفية وتضخيم الإشارات. مكبر للصوت التفاضلية متصلاً بالمجلس اقتناء محطة طرفية. كابميتير، تصحيح المشبك البرمجيات التي تراقب قدرة الخلية، وقد استخدمت في السابق دراسات20 (انظر الجدول للمواد). يتم الاحتفاظ بتسجيل الدائرة ونضح الحلول عند 37 درجة مئوية.
1. إعداد الماصات للجمعية
<ol><li>سحب الماصات من زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية إلى قطر خارجي من 1.2 مم (انظر الجدول للمواد) استخدام ساحبة ماصة2 .</li>
	<li>البولندية ماصة تستخدم في ميكروفورجي. يجب أن يكون قطر طرف ماصة 2-3 ميكرومتر.</li>
	<li>مكان الماصات في حامل جرة الماصات بطرف ماصة مواجهة (انظر الجدول للمواد). تحذير: الخطوات 1.4-1.6 في غطاء الأبخرة كيميائية جيدة التهوية.</li>
	<li>مزيج سيليكونيزيشن المزيج الذي يتألف من قطره 1 (~ 150 ميليلتر) مكررا (ديميثيلامينو) ثنائي ميثيل سيلاني و 10 قطرات من رابع كلوريد الكربون (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>صب الخليط سيليكونيزيشن في الجرة وإغلاق الغطاء محكم.</li>
	<li>احتضان الجرة مع خليط سيليكونيزيشن ح 24-48 في غطاء الأبخرة كيميائية في درجة حرارة الغرفة حتى يتبخر الخليط تماما.</li>
	<li>الردم الماصة مع الراتنج الأيوني الانتقائي المناسبة لإنشاء عمود لما يقرب من 2-4 مم. ملاحظة: الهيدروجين ionophore أنا ب كوكتيل يمكن تسجيل أوسيدفور نة النشاط (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>اضغط غيض ماصة لتوزيع الراتنج الأيوني الانتقائي لهذه المعلومة، ووضع الماصة عمودياً في حامل جرة مع طرف ماصة أسفل.</li>
	<li>شيكوندير مجهر تشريح أن كوكتيل راتنج قد وصلت إلى نهاية الحافة. إذا لزم الأمر، تطبيق الضغط الإيجابي لدفع الراتنج إلى النهاية.</li>
	<li>الردم النصف-الماصة مع الحل المناسب (~ 100 ميكروليتر). هنا، استخدم بوكل 100 و 10 ملم حبيس في درجة الحموضة 7.0 إذا كان استخدام ionophore أنا ب كوكتيل</li>
	<li>الاتصال في بورصة اسطنبول الكترومتر ووضع طرف بورصة اسطنبول في حمام الحل المستخدم لتسجيل. صفر في الكترومتر.</li>
	<li>اختبار ح+-استجابة بورصة اسطنبول انتقائية عن طريق تغيير الرقم الهيدروجيني للحل حمام. ح متوسط+-انتقائية بورصة اسطنبول استجابة ~ 58 أم كل وحدة من الأس الهيدروجيني.</li>
	<li>دورياً بتقييم استجابة بورصة اسطنبول للمعايرة.</li>
</ol>2-إعداد المشبك التصحيح الماصات للتسجيل
ملاحظة: ينصح الأسلوب وصف دونالد هيلجيمان في مقالته على "تسجيل" قناة واحدة21 .
<ol><li>سحب الماصات لتصحيح العملاقة من زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية (ممود 2.0/1.5 ملم معرف) على ماصة ساحبة2،،من2223.</li>
	<li>استخدام ميكروفورجي التي شنت على مرحلة المجهر المقلوب جعل نصيحة (10-22 ميكرومتر) ماصة واسعة23. تذوب حبة (~ 0.5 مل) من الزجاج الناعمة على سلك البلاتين سميكة ميكروفورجي. ملاحظة: مطلوب سلك البلاتين سميكة نسبيا (~0.5 ملم) اختﻻق الماصات التصحيح العملاقة.</li>
	<li>ضع ماصة التصحيح قريبة من حبة الزجاج الناعمة، وتطبيق الحرارة كاملة حتى يبدأ التلميح الانحسار. سيتم نقل سلك البلاتين قليلاً نحو سينتيردورينج التدفئة.</li>
	<li>إيقاف الحرارة، ودفع طرف الماصة إلى حبة الزجاج خففت. سوف تتراجع سلك التبريد وكسر طرف ماصة.</li>
	<li>قم بإعادة الحرارة إلى نصيحة ماصة على نحو سلس وإنشاء تلميح ماصة للقطر المطلوب. قطر الطرف يتوقف على حجم الخلية لتكون مصححة (8-10 ميكرومترات في هذه الدراسة).</li>
</ol>3-إعداد الخلايا
<ol><li>الاحماء العازلة الفوسفات المالحة (PBS) دون Ca2 + وملغ2 +والحل يدتا التربسين والمتوسطة النمو إلى في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. استخدم 1 مل من المخزن المؤقت للوحة الثقافة الخلية قطرها 35 ملم.</li>
	<li>إضافة 0.5 مل التربسين للخلايا للوحة الثقافة الخلية قطرها 35 ملم. ملاحظة: عندما تبدأ الخلايا مجمله، ويهز لوحة لإلغاء إرفاق الخلايا.</li>
	<li>إيقاف عمل التربسين بإضافة 5 مل (مقدار للوحة الثقافة الخلية قطرها 35 ملم) من متوسط النمو الكامل وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين. ملاحظة: وقت رد الفعل في التربسين نوع من الخلايا التابعة.</li>
	<li>وضع الخلايا على شاكر مع هزاز لمنع تشكيل كتل.</li>
	<li>استخدام الخلايا لتصل إلى 2 حاء بعد تريبسينيزيشن. ملاحظة: قد تختلف الوقت اعتماداً على خط الخلية.</li>
</ol>4-إعداد نظام التروية ماصة البينية
<ol><li>قطع حجم مناسب من الأنابيب الكوارتز (150 ميكرومتر OD/75 معرف ميكرومتر) لإعداد خط التروية الماصة داخل.</li>
	<li>إدراج جانب واحد من الأنابيب الكوارتز في تلميح ماصة 200 ميليلتر. الصق الأنبوب مرو على الحافة، وقطع نهاية الحافة مع شفرة حلاقة حادة.</li>
	<li>قم بتوصيل خط التروية (أنابيب الكوارتز لصقها على الطرف) قطعة صغيرة من السيليكون الأنابيب التي ستكون بمثابة مستودع للحل نضح الماصة داخل.</li>
	<li>قم بتوصيل أنابيب السيليكون حقنه خلق ضغط إيجابي.</li>
	<li>إدراج الموانئ الحرة نهاية الأنبوب الكوارتز من خلال الأنبوب البولي إثيلين حامل ماصة نضح (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>تقييم خط التروية مع الحل ماصة.</li>
</ol>5-إعداد الحلول
<ol><li>تعد حلاً ماصة مخزنة بشكل كبير لتسجيل نة (1 مم عطا، 0.5 مم مجكل2, ملم 10 ملغ-ATP، 12.5 ملم حبيس 115 مم البوتاسيوم اسبارتاتي (الصناعية)، وأنابيب 12.5 ملم والممسحات 12.5 ملم و 12.5 ملم مس، pH 6.0 تعديلها مع حمض الأسبارتيك). ملاحظة: إعداد ماصة الأسهم الحل والتصفية. إضافة ATP ملغ قبل التسجيل.</li>
	<li>إعداد حل حمام جديدة في كل مرة (140 ملم كلوريد الصوديوم، كاكل 2 مم2، 2 مم مجكل2، ومم 0.1 تريس-HCl pH 8.2).</li>
</ol>6-تسجيل نشاط الناقل
<ol><li>الحفاظ على دائرة التسجيل وكافة الحلول في 37 درجة مئوية، لأن نشاط الناقل تعتمد على درجة الحرارة.</li>
	<li>وضع الخلايا في قاعة التسجيل. انتظر حتى أنهم إسقاط إلى أسفل الدائرة ولكن لا تدع لهم إرفاق إلى الدائرة.</li>
	<li>اختر خلية مناسبة. قياس قطر الخلية مع ميكرومتر بصري. اختر الخلايا مع أقطار مشابهة. ملاحظة: عموما، خلية كبيرة سيكون أكثر الخلوية السطحية وربما أكثر الناقلين عن لها غشاء البلازما، وهكذا أيضا وجود نشاط الناقل أكثر. ومع ذلك، هذا غير صحيح بالضرورة، كما نقل النشاط يعتمد على الناقل محددة ونوع الخلية قيد الدراسة.</li>
	<li>جبل ماصة ميكرويليكترودي الأيوني الانتقائي ميكرومانيبولاتور، والردم ماصة لقط التصحيح مع الحل داخل الخلايا، يجب التأكد من أن الحل الذي يصل إلى طرف ماصة2. ملاحظة: قد يتطلب عدة صنابير لطيف للقضاء على فقاعات في تلميح الماصة.</li>
	<li>جبل ماصة لقط التصحيح إلى مرحلة الرأس الكهربية إعداد2،،من2223. ملاحظة: من المهم إبقاء مرحلة الرأس بزاوية 45 درجة على المحور الأفقي، كما يضمن زاوية دخول الماصة التي مناسبة لتشكيل الختم شديدة المقاومة.</li>
	<li>تطبيق ضغط إيجابي صغير (~ 5 سم ح2س) إلى ماصة التصحيح تقليل فرصة لعرقلة التلميح، ووضعه في حمام الحل.</li>
	<li>إيقاف نقل ماصة المشبك التصحيح بمجرد التلميح يقع بالقرب من الخلية.</li>
	<li>تخفيف الضغط الإيجابي بينما ماصة يمس الخلية وتطبيق ضغط سلبي طفيف (~ 5 سم ح2س) للحصول على > 1000 ختم MΩ (جيجا أوم) على غشاء الخلية مع التصحيح "الماصة؛"23.</li>
	<li>ضع ماصة التصحيح مع الخلية في نفس المستوى البؤري كما بورصة اسطنبول، ونقل ماصة التصحيح مع الخلية بالقرب من بورصة اسطنبول (~ 5-10 ميكرون)2،5 ولكن تجنب السماح للخلية إلى الاتصال ببورصة اسطنبول (الشكل 1A).</li>
	<li>أؤكد أن عقد المحتملة 0 أم.</li>
	<li>تمزق الختم مع مجموعة من سوكشنز قصيرة الحصول على تكوين كامل الخلية.</li>
	<li>الانتقال إلى بورصة اسطنبول (أو ماصة المشبك التصحيح) ببطء اليسار أو من أعلى إلى أسفل تسجيل نشاط الناقل (الشكل 1B).</li>
	<li>سجل قمم على الأقل 5-8 (الشكل 1، من أ إلى ب).</li>
	<li>تطبيق مربع موجه اضطرابات أثناء التسجيل لمراقبة نوعية الختم والسعة غشاء الخلية (الشكل 1).</li>
	<li>تقدير تدفق ح+ (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) من الفرق في تركيز ح+ الحرة بين سطح الخلية والحل الأكبر (ΔH+) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> ملاحظة: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> و <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> ح+ والمخزن المؤقت معاملات نشرها على التوالي، بر هو تركيز المخزن المؤقت الإجمالية، كد ثابت تفكك المخزن المؤقت، r هو الخلية دائرة نصف قطرها، و <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> يحدد تغيير الحالة المستقرة في تركيز ح منضم+ لتغيير طفيف في ح الحرة+. ح+ يشير إلى بروتون مجاناً في الحل. أن تكون متسقة مع الدراسات السابقة، يتم تحويل الدفقات ح+ إلى وحدات التمويه الكهربية عن طريق حساب مكافئات الحالية للتدفقات (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) في السلطة الفلسطينية3،5].</li>
	<li>تطبيع تدفق بروتون إلى سطح الخلية التي يمكن حسابها من حجم الخلية أو السعة الغشاء.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiating+SLC+transporter+activity:+Emerging+drug+discovery+opportunities.">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li><li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes.">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li><li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na+/H++exchanger-3.">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na/H+exchanger+(NHE1)+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na/2H+stoichiometry.">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium/hydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods.">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li><li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na(+)/P(i)+cotransporter.">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li><li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures.">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li><li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+extracellular,+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes.">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).</li><li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).</li><li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+mammalian+sodium/proton+exchanger+SLC9+gene+family.">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li><li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium/proton+exchangers.">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li><li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers:+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia.">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li><li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9/NHE+gene+family,+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na(+)/H(+)+exchangers.">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li><li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+intestinal+Na+/H++exchange.">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li><li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na+/H++exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction.">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li><li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance.">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li><li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters.">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19 (2001).</li><li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region.">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li><li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na+/H++exchanger.">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li><li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell.">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li><li>Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).</li><li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+membrane+patches:+improvements+and+applications.">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li><li>Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).</li></ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

وعلى الرغم من المهام الحاسمة للناقلين، الطرق المتاحة لدراسة نشاطها غير فعالة وغير كافية. قيد واحد أن الأساليب المتاحة قياس حركة أيون توسط نشاط الناقل دون النظر إلى التقلبات في تكوين أيون داخل الخلايا أثناء التجربة4. طريقة عرض يضمن مراقبة دقيقة من التراكيب أيون خارج الخلية وداخل الخلية ويوفر أداة قوية لتعديل الأيونات داخل الخلايا، البروتين والدهن التراكيب3،4،5.
أن أهم خطوة في هذا البروتوكول هو إعداد بورصة اسطنبول أن مستقر ل فترة طويلة25. في تجربتنا، بورصة اسطنبول غير مستقرة لا سيليكونيزيد جيدا (مثلاً، يتم إعادة توزيع الراتنج الأيوني الانتقائي على الجانبين ماصة بورصة اسطنبول)، التي يمكن الكشف عنها بواسطة انجراف ثابتة ولا يمكن السيطرة عليه في إشارة بورصة اسطنبول. بالإضافة إلى ذلك، توزيع الراتنج في بورصة اسطنبول ينبغي أن ترصد عن كثب أثناء التجربة. وقد دفع الحل حمام الراتنج الأيوني الانتقائي داخل الماصة بورصة اسطنبول، إنشاء عمود من حمام الحل قبل الراتنج25. في هذه الحالة، سوف سجل تركيز أيون من هذا العمود بورصة اسطنبول وتصبح nonresponsive للتغييرات في التدرجات أيون أثناء التجربة. ضبط هندسة بورصة اسطنبول هو المفتاح الحصول على استجابة بورصة اسطنبول في المجموعة من 100 مللي ثانية9 والتغلب على التأخيرات المحتملة في بورصة اسطنبول الوقت-الردود مقارنة بالتغيرات في التدرجات أيون.
الحد الرئيسية من طريقة عرض موروث من التصحيح لقط قياس نشاط الناقل في الخلايا الظهارية. عند فصل من الدعم، وأبقى على التعليق، قد تفقد الخلايا الظهارية الاستقطاب التعريب المستقطبة من الناقلين على غشاء قمي أو باسولاتيرال.
ينبغي أن تستخدم تصحيح تعديل لقط القياس عند دراسة القنوات والناقلين في epithelia الاستقطاب. إذ ترى أن الخلايا قد التقريبية إلى اسطوانة بدلاً من مجال المهم عند تحويل التدرج ح+ إلى التمويه عن طريق الصيغة المقدمة. في هذه الحالة، يجب تغيير الصيغة إلى <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq7.jpg"> حيث λ هو طول الاسطوانة، r هو نصف قطر الاسطوانة، الإعلان العاشر هو المسافة الشعاعية من منتصف الاسطوانة التي التدرج هو قياس5. ينبغي أن تركز التنمية المستقبلية لهذه التقنية القوية لدراسة اليكترونيوترال الناقلين على تعديل الأسلوب الأمثل خلايا التسجيل التي نمت في أحادي الطبقة.

نقل الأيونات والذوائب عبر غشاء البلازما ضروري لبقاء الخلايا، ومن ثم للكائنات الحية1. النقل الانتقائي من الأيونات والذوائب يتحقق من خلال مجموعة من القنوات المتخصصة والبروتينات الناقل. كثيرا ما تؤدي الطفرات في هذه البروتينات في مجموعة متنوعة من الظروف السريرية، مما يجعل القناة ونقل البروتينات أهدافا محتملة للعلاج الدوائي1. ولسوء الحظ، فهم الآليات الأساسية لوظيفة القناة والناقل والتنظيم غالباً ما تكون محدودة بالنهج المتاحة لدراسة عن النشاط2،،من34.
على وجه التحديد، الناقلين يمكن تقريبا دون تقسيمها إلى مجموعتين كبير تبعاً لما إذا كان أنهم تغيير إمكانيات transmembrane الخلية أثناء نقل الذوائب: الناقلون أيون وآﻻت تغيير [مثلاً -فوسفات الصوديوم 2a الناقل المشارك (NaPi2a)، مبادل الصوديوم-الكالسيوم (نك)، إلخ.] أو الناقلين غير تغيير أيون اليكترونيوترال [مثل مبادل الصوديوم-بروتون (نة)، وكلوريد الصوديوم الناقل المشارك، NaPi2c، إلخ.]. وقد درست أنشطة كل من الفئات من الناقلين على نطاق واسع باستخدام امتصاص نظائر المشعة والأصباغ الفلورية غشاء بيرمينت2. كلا النهجين تقدير نشاط الناقلين بقياس التغيرات في تركيز الجزء الأكبر من أيونات هيولى محددة، وكلا الأسلوبين على قيود، مثل حساسية معتدلة والقرار الوقت وعدم كفاية الرقابة من داخل الخلايا الوسط. وفي الواقع، نشاط العديد من شركات النقل تعتمد على تركيز أيونات يجري بها (مثلاً، NHE3، نك) هيولى، والتغيرات في تركيزات أيون هذه من المتوقع أن تلعب دوراً هاما في تنظيم نقل النشاط2 , 3 , 5-القياس الدقيق لهذه الآليات التنظيمية ويقتصر استخدام الأساليب الكلاسيكية.
للتغلب على هذه القيود، تستخدم أساليب المشبك التصحيح لدراسة نقل النشاط2،6. على وجه التحديد، ذات مرجعية ذاتية أقطاب الأيوني الانتقائي (الجمعية)7،8 جنبا إلى جنب مع التصحيح لقط النظام سمح مؤخرا بقياس اليكترونيوترال نقل النشاط3،4 , 5-الجمعية على أساس حقيقة أن يخلق نشاط الناقل تدرج أيون بالقرب من غشاء الخلية. بورصة اسطنبول نقل ما يصل إلى وبعيدا عن غشاء الخلية في المتكررة، أزياء متذبذبة سجلات فرق جهد (µV). الاختلافات الجهد يمكن تحويلها إلى قيم الجريان أيون باستخدام أسلوب معايرة التي يتم تطبيق أول قانون فيك للانتشار2،9. بينما يتم استخدام الجمعية للكشف عن تدفق الأيونات تتحرك من الخلايا، طريقة المشبك التصحيح في كلا كامل الخلية أو تكوينات من الداخل إلى الخارج يستخدم للتحكم في تكوين غشاء أيون داخل الخلايا والمحتملة. وعلاوة على ذلك، تطبيق تقنية المشبك التصحيح العملاقة يسمح بتعديل تكوين الأيونات ليس فقط ولكن أيضا3،الدهون والبروتينات5داخل الخلايا.
وباختصار، براعة الأسلوب المشبك التصحيح بالمقارنة مع أن نشاط الناقل جعلت من أساليب أخرى لدراسة تصحيح لقط مناسبة للتغلب على القيود الشائعة لهذه الأساليب الأخرى. المزيج من الذاتي الرجوع إلى الجمعية وتقنيات المشبك التصحيح يوفر إمكانية فريدة لقياس نشاط الناقلين اليكترونيوترال في بيئة تجريبية الخاضعة لأحكام الرقابة واكتشاف رواية الفيزيائية-الحيوية والجزيئية خصائص لغشاء الخلية النقل3،،من45. هذا النهج قد استخدمت بنجاح لدراسة نشاط نة. الأسرة البروتين نة الثدييات يحفز تبادل الصوديوم خارج الخلية (نا+) صافي اليكترونيوترال للبروتون داخل الخلايا (ح+)10،11 الاستفادة تدرج نا+ إلى الداخل. في الثدييات، وتضم الأسرة البروتين نة 11 البروتينات ذات الصلة (NHE1-9 و NHA1-2)، وخاصة بالحيوانات المنوية نة10،،من1213.
نيس (عائلة SLC9a) تم العثور على أوبيكويتوسلي في معظم الكائنات الحية من بدائيات النوى بسيطة إلى أعلى حقيقيات النوى ويشاركون في مجموعة متنوعة من الخلية الحيوية وظائف10،11، بما في ذلك السيطرة على الدفاع الملوحة الخلية في بدائيات النوى، الحفاظ على التوازن وخلية حجم حمض-قاعدة، وتنظم امتصاص الماء والملح في مختلف epithelia المتخصصة10،،،من1214،15. الأدوار البيولوجية الرئيسية من نيس وأهمية وظائفهم قد حددت من خلال العديد من الدراسات؛ ومع ذلك، حققت بضعة دراسات الخصائص الفيزيائية-الحيوية والجزيئية للثدييات نيس بسبب القيود المنهجية4. في الآونة الأخيرة، قد كشفت عن تطبيق الذاتي الرجوع إلى الجمعية أثناء تصحيح كامل الخلية لقط الآليات الجزيئية رواية من isoforms نة تخضع لتغييرات في تركيزات الأيونات والبروتينات وشكلها3، داخل الخلايا 4.
على وجه التحديد، يحدد البروتوكول المنصوص عليها في هذه المخطوطة بأساليب ونهج لدراسة النشاط وتنظيم isoform نة 3 (NHE3)، لاعبا رئيسيا في امتصاص Na+، Cl–،– HCO3والسوائل في فرشاة الحدود غشاء ابيثيليا الكلوية والمعوية14،16. نظرة جديدة إلى الاختلافات في حساسية النشاط NHE3 إلى فوسفوينوسيتيديس داخل الخلايا (فوسفاتيديلينوسيتيدي 4، 5-بيسفوسفاتي [P2 PI (4، 5)] وفوسفاتيديلينوسيتيدي 3,4,5-ثلاثي [PI(3,4,5]P3]) يقال. خلية النقل البروتينات، مثل القنوات والناقلين، وينظم فوسفوينوسيتيديس17، و NHE3 مباشرة تربط PI (4، 5) P2 و P3 PI (3,4,5)18. تستند إلى الكتابات الحالية، أما فوسفوينوسيتيدي يمكن أن تكون ذات صلة لتنظيم الفسيولوجية أو الفيزيولوجية المرضية NHE35،،من18إلى19. دعم النتائج التي توصلنا إليها أدوار منفصلة ل PI (4، 5) P2 و P3 PI (3,4,5) في تنظيم النشاط NHE3. وكان هذا التمييز ممكن بسبب تطبيق تقنيات بورصة اسطنبول في تركيبة مع تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية. يسمح هذا الأسلوب أيضا السيطرة على المحتوى فوسفوينوسيتيدي الخلوية عن طريق نضح داخل الخلايا من فوسفوينوسيتيديس مختلفة أثناء قياس النشاط NHE3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Patch clamp Amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:276px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-1650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Differential Amplifier (DP-301)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Patch Clamp Software Based on MatLab</td>
			<td style="width:219px;">MatLab with acquisition toolbox</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>The capmeter software is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">ThermoClamp-1 Temperature Control System</td>
			<td>&#160;AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:101px;">03-11-LL</td>
			<td>In-line heater</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:101px;">1B120F-3&#160;&#160;</td>
			<td style="width:276px;">Used for ion selective electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14755-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Carbon tetrachloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">319961-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Hydrogen ionophore I - cocktail B</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">95293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Thin Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:219px;">&#160;Sutter Instrument</td>
			<td style="width:101px;">B200-156-15</td>
			<td style="width:276px;">Used for patch clamp pipette&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td>
			<td style="width:219px;">Molex (Polymicro Technologies)</td>
			<td>106815-0018</td>
			<td style="width:276px;">Used for intra-pipette perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Potassium aspartate&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">EGTA</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">PIPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MOPS</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Tris</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Apyrase</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-4508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-3908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

ويضمن نقل الأيونات خلال أغشية الخلية غرامة مراقبة محتوى أيون داخل وخارج الخلية التي لا غنى عنها لبقاء الخلية. آليات النقل هذه هي توسط أنشطة البروتينات المتخصصة الناقل. على وجه التحديد، ناعما يسيطر ديناميات الأس الهيدروجيني غشاء البلازما بروتون (H+) البثق النظم، مثل Na++ /H مبادل (نة) البروتين الأسرة. وعلى الرغم من الجهود المكثفة دراسة الآليات الكامنة وراء تنظيم نة، فهمنا الحالي للخصائص الفيزيائية-الحيوية والجزيئية للأسرة نة غير كافية بسبب محدودية توافر أساليب لقياس فعالية النشاط نة . في هذه المخطوطة، استخدمنا ح+-أقطاب انتقائية خلال كامل الخلية التصحيح تسجيل لقط لقياس التدفق الناجم عن نة ح+ . واقترحنا هذا النهج للتغلب على بعض القيود التي تفرضها عادة تستخدم أساليب لقياس النشاط نة، مثل الإقبال المشعة والغشاء الفلورسنت بيرمينتس. يمكن قياس نشاط نة باستخدام الأسلوب هو موضح حساسية عالية ووقت القرار ومراقبة أكثر فعالية لتركيزات ح+ داخل الخلايا. ح+-أقطاب انتقائية يتم على أساس حقيقة أن يخلق نشاط الناقل تدرج أيون بالقرب من غشاء الخلية. ح+-القطب الانتقائي نقل تصل إلى وبعيدا من غشاء الخلية بطريقة متكررة ومتذبذبة سجلات فرق جهد اعتماداً على التمويه ح+ . بينما ح+--يتم استخدام أقطاب انتقائية للكشف عن التمويه ح+ تتحرك خارج الخلية، يتم استخدام أسلوب المشبك التصحيح في تكوين كل خلية للتحكم في تكوين أيون داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، يسمح تطبيق أسلوب المشبك التصحيح العملاقة بتعديل تكوين الأيونات ليس فقط ولكن أيضا الدهون داخل الخلايا. تم قياس نشاط الناقل isoform نة 3 (NHE3) باستخدام هذا النهج التقني إلى دراسة الأساس الجزيئي للتنظيم NHE3 قبل فوسفوينوسيتيديس.

لدراسة تنظيم النشاط NHE3 تطبقها فوسفوينوسيتيديس بورصة اسطنبول ذات مرجعية ذاتية أثناء تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية. واستخدمت PS120 تنتجها الخلايا الليفية مثل الخلايا24، التي تفتقر إلى التعبير عن غشاء البلازما الذاتية نيس،. NHE3 البرية من نوع (NHE3-wt) أو طفرات NHE3 التي لا فوسفوينوسيتيديس ربط [تيروزين 501، ارجينين 503 و 505 يسين تم استبداله بالأنين، Y501A/R503A/K505A (NHE3-يرك)] أبديت [ستبلى] في PS120 تنتجها الخلايا الليفية مثل الخلايا18.
وترد في الشكل 2الآثار. الخلية هالدين تكوين كامل الخلية قبل ماصة للتصحيح لقط، وبورصة اسطنبول وضعت أمام الخلية. في هذا الموقف، سجلت بورصة اسطنبول تركيز مجاناً ح+ قريبة من غشاء الخلية (الشكل 1A)؛ ثم بورصة اسطنبول (أو ماصة المشبك التصحيح) تم نقلها يدوياً جانبياً 50 ميكرومتر وسجلت تركيز مجاناً ح+ في الحل (الشكل 1B). الاختلافات الجهد مسجل، المقابلة لوظيفتي ماصة التصحيح مع الخلية أمام أو بعيداً عن بورصة اسطنبول، هي الممثل للنشاط NHE3 (الشكل 1). نضح داخل الماصة من أبيراسي (ATP-ديفوسفاتاسي) يقلل من تركيز داخل الخلية ATP، تناقص المحتوى فوسفوينوسيتيدي5في وقت لاحق. باﻻتفاق مع دراسات سبق الإبلاغ عنها5،،من1819، خفض محتوى فوسفوينوسيتيدي انخفاض توسط العلاج أبيراسي نشاط NHE3 (~ 50%)، التي تم تسجيلها كانخفاض في الجهد السعة التذبذب (الشكل 2). انعكس أثر أبيراسي (النظر في 5 وحدات/ml) على النشاط NHE3 تماما من نضح داخل الماصة أبيراسي في تركيبة مع 2 ميكرومتر P3 PI (3,4,5) (الشكل 2 و 3 ألف). ودعمت هذه النتائج بالنشاط NHE3 المسجلة في الخلايا PS120 ستابلي معربا عن طفرات NHE3 (NHE3-يرك) التي كانت غير قادر على ربط فوسفاتيديلينوسيتيديس18. نضح أبيراسي وحدها أو في تركيبة مع PIP3 لا تؤثر على نشاط NHE3 في NHE3-يرك طفرات (الشكل 3B). كان أيضا تثبيط نشاط NHE3 الذاتية بالعلاج أبيراسي في خلايا الكلي (موافق) الابوسوم3. نضح داخل الماصة من P3 PI (3,4,5) عكس تثبيط النشاط NHE3 الناجمة عن أبيراسي في خلايا موافق (الشكل 3). توحي هذه النتائج أن تأثير P3 PI (3,4,5) على نشاط NHE3 لا خلية نوع معين.
المقبل، ونحن تهدف إلى اختبار خصوصية PIP3 في تنظيم أبيراسي بوساطة التغيرات في النشاط NHE3. لقد فعلنا ذلك بفحص أثر على الحد أبيراسي-تعتمد على النشاط NHE3 بعد نضح فوسفوينوسيتيديس أخرى، مثل P2 PI (4، 5). P2 PI (4، 5) (في 10 ميكرون) لا يؤثر انخفاض النشاط NHE3 توسط أبيراسي (الشكل 4 أ). وأخيراً، لم تمنع نضح لامبير-الحزب الوطني التقدمي، بث ATP غير هيدروليسابل، ثيبيراسي-تعتمد على تثبيط النشاط NHE3 (الشكل 4 باء). وتوحي هذه النتائج بدور P3 PI (3,4,5)، ولكن لا P2 PI (4، 5)، في تنظيم NHE3 بعد استنفاد ATP. تحديد أدوار منفصلة بالنسبة PI (4، 5) P2 و P3 PI (3,4,5) في NHE3 التنظيم كان ممكناً فقط بسبب نضح بين الخلايا من فوسفوينوسيتيديس خلال قياسات بورصة اسطنبول جنبا إلى جنب مع المشبك تصحيح كامل الخلية تسجيل5. إجراء محدد P3 PI (3,4,5) بدلاً من P2 PI (4، 5) في تنظيم النشاط NHE3 قيمة لتحديد ما إذا كان فوسفوينوسيتيديس داخل الخلايا مختلفة تنظم وظيفة NHE3 بشكل مختلف.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig1.jpg"> الشكل 1 . التمثيل التخطيطي من ح+ الجريان القياس والعلاقة بين النشاط نة والاختلافات المحتملة التي سجلتها ميكروليكترودي pH. التمثيل التخطيطي لإعداد التسجيل. أ الرسم التخطيطي للإعداد التجريبية الأولى. الخلية عقدت في تكوين كل خلية ماصة المشبك التصحيح ووضعت أمام بورصة اسطنبول. في هذا الموقف، يسجل بورصة اسطنبول تركيز مجاناً ح+ قريبة من غشاء الخلية. باء "بورصة اسطنبول" (أو ماصة المشبك التصحيح) يتم نقله يدوياً جانبياً ~ 50 ميكرومتر ويسجل تركيز مجاناً ح+ في الحل في هذا الموقف. جيم التمثيل الرسومي للاختلافات الجهد تسجيلها باستخدام في بورصة اسطنبول. الذبذبات من موقف (خلية أمام بورصة اسطنبول) ب (خلية أبعد ما يكون عن بورصة اسطنبول) تمثل النشاط نة. تسجيل البرمجيات المستخدمة الجهد الاختلافات سجلتها بورصة اسطنبول وإنشاء مربع موجه اضطرابات (20 mV، 0.2 كيلو هرتز) لرصد السعة غشاء الخلية ونوعية الختم المشبك التصحيح. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56630/56630fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig2.jpg"> الشكل 2 . مثال على التسجيل المحددة لنشاط الناقل NHE3 في خلية واحدة PS120 ستابلي معربا عن NHE3 wt قبل وبعد التروية مع أبيراسي و P3 PI (3,4,5) (PIP3). بعد التسجيل الأولى، كانت تستنفد الخلية من ATP نضح داخل الماصة من أبيراسي. النشاط NHE3 انخفض تدريجيا وأعيدت نضح الماصة داخل PIP3. تتم الإشارة إلى إضافة أبيراسي بشريط أحمر، ويشار إلى إضافة PIP3 بشريط أخضر. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56630/56630fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig3.jpg"> الشكل 3 . تأثير استنفاد ATP ونضح PIP3 في NHE3 نقل النشاط في الخلايا PS120 وموافق. أثر استنفاد ATP بوساطة أبيراسي على النشاط NHE3 والاحتفاظ بتأثير أبيراسي على النشاط NHE3 الناجمة عن PIP3 داخل الماصة التروية: الخلايا PS120 أ إذ تعرب عن NHE3-wt أو باء. PS120 الخلايا وإذ تعرب عن NHE3-يرك، طفرات NHE3 غير قادر على ربط فوسفوينوسيتيديس. جيم الخلايا موافق معربا عن NHE3 الذاتية. وتظهر دوائر صلبة متوسط البيانات من التجارب الفردية (أربع تجارب أجريت في ظروف مماثلة). أشرطة الخطأ تمثل وسائل ± الأخطاء المعيارية (جنوب شرق). * ف < 0.05 مقابل السيطرة، ANOVA. $ ف < 0.5، أبيراسي < 0.01 $$P مقابل أبيراسي + PIP3، ANOVA. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56630/56630fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig4.jpg"> الشكل 4 . أثر P2 PI (4، 5) (PIP2) والشرطة الوطنية اﻷنغولية PNP التروية في النشاط NHE3 بعد استنفاد ATP. تأثير أ. PIP2 أو باء. نضح الماصة داخل الشرطة الوطنية اﻷنغولية PNP بخفض أبيراسي-تعتمد على النشاط NHE3 في الخلايا PS120 الإعراب عن NHE3-الوزن دوائر صلبة تظهر متوسط البيانات من التجارب الفردية (أربع تجارب أجريت في ظروف مماثلة). تمثل أشرطة الخطأ ± الوسائل ذاتها * P < 0.05، * * ف < 0.01 مقابل السيطرة، ANOVA. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56630/56630fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters at JoVE.com

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

ويصف هذه المخطوطة تطبيقات أقطاب انتقائية بروتون والتصحيح لقط أساليب لقياس نشاط نظم النقل بروتون. هذه الأساليب التغلب على بعض القيود المفروضة على التقنيات المستخدمة عادة لدراسة نشاط النقل بروتون، مثل الحساسية معتدل ووقت القرار ومراقبة الوسط داخل الخلية غير كافية.

تطبيق القياس الكهربية لدراسة نشاط الناقلين محايدة الكهربائية

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

6.9K Views.  Des Moines University. ويصف هذه المخطوطة تطبيقات أقطاب انتقائية بروتون والتصحيح لقط أساليب لقياس نشاط نظم النقل بروتون. هذه الأساليب التغلب على بعض القيود المفروضة على التقنيات المستخدمة عادة لدراسة نشاط النقل بروتون، مثل الحساسية معتدل ووقت القرار ومراقبة الوسط داخل الخلية غير كا?...

Video: Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

تطبيق على microfluidics لالكهربية

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

شبه الآلي التحليل البصري نبضات القلوب الصغيرة

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

الحبل الشوكي الكهربية

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

تطبيق MassSQUIRM لقياسات كمية من نشاط Demethylase ليسين

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

مقدمة إلى صلب غشاء المعتمدة واستنادا الكهربية

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

إعادة بناء 3 الأبعاد حجم الأنسجة وتطبيقاتها لدراسة ماوس الغدد الثديية

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

عالية الإنتاجية تحليل صورة الأجسام الشبه الكروية ورم: A برمجيات صديقة للمستخدم التطبيق لقياس حجم الأجسام الشبه الكروية تلقائيا وبدقة

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

قياس اليرقات آخر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مراقبة النشاط

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...