هذا العمل كان يدعمها "البرنامج شوارتز لام برنارد" "الطبيب العلماء" في جامعة روكفلر، صندوق التنمية العلاجية روبرتسون في "جامعة روكفلر"، ومركز ساكلير للطب الحيوي وأبحاث التغذية في جامعة روكفلر.

جميع إجراءات أقرتها جامعة روكفلر &#39; s "رعاية الحيوان المؤسسية" و "استخدام اللجنة". تم إيواء جميع الحيوانات تحت ظروف معينة خالية من مسببات المرض.
 1-إنزيمية في المختبر <ol><li>الثقافة THP-1 الخلايا 6 في روزويل بارك التذكاري معهد 1640 (RPMI 1640) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و (2-هيدروكسيثيل)-1-4- حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك (حبيس؛ 25 مم) (إتمام الإعلام)، الحفاظ على الكثافة بين 0.5-1.0 × 10 6 خلايا/مل.</li>
	طبق <li>في 35 مم خلية ثقافة، تسمية 3.5 × 10 5 THP-1 الخلايا كل حالة مع أسيتوكسيميثيل كالسين (كالسين-صباحا؛ 2.5 ميكرومتر) أو أخرى صبغة الفلورسنت مناسب في وسائل الإعلام كاملة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 
	ملاحظة: يجب أن تكون الأصباغ نفاذية غشاء الخلية ومتوافقة مع وسم الخلية يعيش.</li>
	<li>الحارة قبل قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية. 
	ملاحظة: بالإضافة إلى التحكم في درجة الحرارة، وظيفة الأسفل القراءة مطلوباً أيضا. راجع الخطوة 1.10.2 عن بديل لقارئ لوحة للتحديد الكمي لترحيل الخلايا.</li>
	<li>بينما يتم تسمية الخلايا، تعد لوحة المقايسة ومجلس النواب-
	لوحة <ol><li>استخدام ثقافة الأنسجة 24-جيدا، مع شرط واحد كل بئر. أداء كل شرط في ثلاث نسخ.</li>
		<li>ميليلتر إضافة 750 من هانك &#39; s خفف الملح الحل (حبس) مخزنة مع 25 مم حبيس و 0.1% البقري ألبومين المصل (BSA) للوحة 24-جيدا. وهذا بمثابة شرط التحكم القاعدية.
		آبار <ol><li>استخدام أخرى لشروط المقارنة، دائماً الحفاظ على الحجم الإجمالي في الدائرة السفلي في 750 ميليلتر. 
			ملاحظة: في هذا المثال، يخدم البشرية الوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1) كعنصر إيجابي إنزيمية 7.
			<ol><li>تجميع خليط كاشف عن طريق الجمع بين حبس مع 25 مم حبيس، جيش صرب البوسنة (0.1%)، والعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 (75 نانوغرام/ملليلتر). استخدام مصل بقرى الكبار (2.7% v/v) مع العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 كعنصر إيجابي إضافي. 
				ملاحظة: يتوقف تركيز تشيموكيني وتشيموكيني على المحور تشيموتاكتيك قيد الدراسة. هو حراكه العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 المجففة بالتبريد في الماء المقطر مع جيش صرب البوسنة (0.1 ٪) لجعل حل أسهم بتركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل. وهذا يمكن أن تضعف في المياه لإيجاد حل عملي من 10 ميكروغرام/مل. إضافة ميكروليتر 5.6 هذا الحل إلى مجلس النواب-</li>
			</ol></li></ol></li> <li>بعد اكتمال تشكيل الدوائر أسفل مكان إدراج مسامية في كل بئر، ضمان أن الإدراج علامات تبويب محاذاة مع الشقوق اللوحة. 
		ملاحظة: اختر حجم المسام المناسبة لإدراج. وحيدات الخلايا الليمفاوية، وحجم مسام ميكرومتر 3 أداء جيدا. قد تتطلب بعض أنواع الخلايا و/أو أنظمة تشيموكيني على سطح معدني مغلف بمصفوفة للهجرة المثلى. على سبيل المثال، لقياس THP-1 الوحيدات به نحو العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1, فيبرونيكتين أو إدراج المغلفة بالكولاجين ينصح. يجب أن يكون الإدراج لوحة للقارئ كوانتيتاتيون، طلاء ضوء إيمبيرميانت، مثل البولي ايثلين، لمنع الكشف عن عدم ترحيل الخلايا في الجزء العلوي للدائرة 8.</li>
	</ol></li> <li>بعد حضانة الخلايا لمدة 30 دقيقة مع كالسين صباحا، نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. فحص خلايا أجهزة الطرد المركزي في 1,000 ز x للحد الأدنى 2 بصريا الخلايا للتأكد من الإقبال على كالسين-صباحا ( الشكل 1).</li>
	<li>بعناية إزالة المادة طافية باستخدام الشافطة فراغ. أغسل المسمى خلايا خالية من المصل ربمي 1640 تستكمل مع حبيس 25 مم. الطرد المركزي خلايا في 1,000 س ز 2 دقيقة وتجاهل المادة طافية.</li>
	<li>الخلايا ريسوسبيند في المصل خالية ربمي 1640 تستكمل مع حبيس 25 مم. حساب عدد الخلايا وضبط مستوى الصوت حيث تكون الخلايا بتركيز نهائي من 1.0-1.5 × 10 6 خلايا/مل.</li>
	<li>الاستغناء عن 250 ميكروليتر من تعليق خلية في الإدراج (مجلس الشيوخ)-</li>
	<li>بعد جميع الدوائر العليا قد ملئت، بلطف رفع اللوحة، وفحص الجزء السفلي من فقاعات الهواء التي قد تتداخل مع الهجرة والكشف عن وجود. لإزالة فقاعة، أول محاولة إزالة ثم إعادة تعيين موضع الإدراج. إذا فشل، استخدم إبرة ز 27 لثقب الفقاعة، وثم إعادة تحديد موضع الإدراج.</li>
	<li>بوضع اللوحة في قارئ لوحة قبل حرارة 37 درجة مئوية.
	<ol><li>الحصول على قراءات الأسفار من أسفل عند فواصل زمنية دقيقة 1-3. عند استخدام كالسين-صباحا، تعيين الأسفار أطوال موجية الإثارة والانبعاثات في 485 نانومتر و 520 نانومتر، على التوالي. الاعتماد على نظام تشيموكيني ونوع الخلية، تحدث به عادة ما يزيد على 1-4 ح ( الشكل 2A).</li>
		<li>كبديل للقياسات المستمرة باستخدام قارئ لوحة، صورة الآبار باستخدام مقلوب فلورسنت مجهر ( الشكل 2) قادرة على الإثارة والكشف عن الضوء في 485 نانومتر و 520 نانومتر، على التوالي. استخدم تكبير منخفض لالتقاط معظم الجانب السفلي الإدراج. تحديد الخلايا بمعالجة الصور مع إيماجيج أو برامج مماثلة 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. نقل التبني "لمفاوية مورين" <ol><li><ol><li>أنيسثيتيزي 8-12 أسبوع من إعداد الخلايا المانحة-الفئران الذكور المانحة C57BL/6J القديمة مع isoflurane التخدير (1-3%) باستخدام المبخر. تأكيد عمق المناسبة للتخدير بأصبع القدم-قرصه-</li>
		<li>ضع الماوس في موقف ضعيف. جعل شق خط الوسط مع مشرط وتحديد موقع الطحال في الفضاء البريتوني الأيسر العلوي. المكوس الطحال كلها وفي وسائل الإعلام كاملة (RPMI تستكمل مع 10% FBS و 25 مم هيبيس؛ 1 مل/الطحال) على الجليد. Euthanize الحيوانات تخديره من الجهات المانحة بقطع الرأس-</li>
		<li>طحن أنسجة الطحال بلطف من خلال 40 ميكرون النايلون في وسائط كاملة (1 مل/spleen) باستخدام نهاية المكبس حقنه لجعل تعليق خلية واحدة ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل.</li>
		<li>4 إضافة كميات من كلوريد الأمونيوم البوتاسيوم (ACK) تحلل المخزن المؤقت واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة الكريات الحمراء.</li>
		<li>الطرد المركزي الخلايا في 1,000 س ز 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية. إذا بقيت الكريات الحمراء في بيليه، ريسوسبيند في المخزن المؤقت لتحلل ACK، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي خلايا في غ س 1,000 لمدة 2 دقيقة وتجاهل المادة طافية.</li>
		<li>ريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام كاملة بتركيز 2-5 × 10 7 خلايا/مل، ثم سلالة تعليق خلية عن طريق شبكة نايلون 40 ميكرون لإزالة الحطام الخلية.</li>
		يعيش <li>التسمية 1 × 10 7 خلايا والمتلقي الماوس مع صبغة فلورسنت متوافقة مع الخلايا، والتي سيتم الاحتفاظ عند التثبيت لاحقاً، مثل 5-تشلوروميثيلفلوريسسين اسيتات (تركيز نهائي 2 ميكرومتر) 10 . احتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 
		ملاحظة: لتعقب السكان خلية واحدة أو أكثر، استخدم الأصباغ الفلورية الأخرى مع السكان خلية إضافية. سبيل، يمكن أن توصف بجزء من خلايا المانحين مع البنزويل 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)) الأمينية) تيتراميثيلرهوداميني (تركيز نهائي 2 ميكرومتر) 11-</li>
		<li>إضافة 4 وحدات حبس تكملها 25 مم هيبيس، ثم الطرد المركزي في س 1,000 ز 2 دقيقة وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه في حبس وتستكمل مع حبيس 25 مم بتركيز 1 × 10 8 خلايا/مل نهائي.
		<ol><li>في حالة استخدام أكثر من صبغة الفلورسنت، إبقاء السكان خلية منفصلة حتى قبل الحقن مباشرة.</li>
			<li>نقل من قاسمة صغيرة (10 ميكروليتر) من الخلايا لكل لون إلى حل مثبت (1 مل) تعويض اللاحقة التدفق الخلوي-</li>
		</ol></li></ol></li> <li>ونقل الخلايا الليمفاوية <ol><li>تخدير الأسبوع 8-12-القديمة C57BL/6J ذكور الفئران المستفيدة مع إيسوفلوراني (1-3%) باستخدام المبخر؛ تأكيد عمق التخدير عن طريق رشة إصبع القدم. تطبيق مرهم البيطرية للحيوان &#39; العيون s لمنع تجفيف.</li>
		<li>بإيجاز دوامة المانحة الخلايا (1 ثانية) ونقل إلى 1 مل حقن حقنه مع 27 غ، 0.5 في إبرة، الجمع بين السكان خلية مسماة متفاوتاً، إذا كان ذلك ممكناً.
		<ol><li>نقل من قاسمة صغيرة (10 ميكروليتر) من الخلايا المختلطة إلى حل مثبت (1 مل) لتحليل تدفق اللاحقة الخلوي-</li>
		</ol></li> <li>مكان الحيوانات المانحين في موقف المعرضة. تطبيق الضغط والذيلية خفيفة على الجلد الظهرية للعين، مما تسبب في مقلة العين نتا قليلاً.</li>
		<li>المباشر الإبرة ميديالى وحقن 100 ميليلتر من تعليق الخلية المانحة الرجعية أوربيتالي كل الماوس المتلقية. ويمكن أيضا حقن الخلايا عن طريق الوريد الذيل.</li>
		<li>تدريجيا سحب إبرة حقن وضع الماوس وحدها في قفص انتعاش. مراقبة الحيوانات حتى قد وعيه؛ عودة مرة تماما المستردة الحيوان للإسكان الاجتماعي-</li>
	</ol></li> <li>جمع وتحليل <ol><li>بعد ح 1، تخدير الفئران المستفيدة مع التخدير إيسوفلوراني (1-3%) باستخدام المبخر؛ وتأكيد عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين. حصاد الطحال (أو الأنسجة الأخرى للفائدة) (الخطوة 2.1.2.) من كل مستلم الماوس والمكان إلى وسائط كاملة (1 مل والمتلقي). Euthanize الحيوانات تخديره بقطع الرأس- 
		ملاحظة: سوف تزيد فترات أطول قبل الحصاد الأنسجة تراكم الأنسجة من خلال على الأقل 24 h.</li>
		<li>طحن أنسجة الطحال بلطف من خلال 40 ميكرون النايلون في وسائط كاملة باستخدام نهاية المكبس حقنه لجعل تعليق خلية واحدة ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل.</li>
		المخزن المؤقت <li>4 إضافة مجلدات من تحلل ACK واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي من تعليق خلية في 1,000 س ز 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل المادة طافية.</li>
		المخزن المؤقت <li>الخلايا ريسوسبيند في تلطيخ (المالحة مخزنة الفوسفات وتستكمل مع 1% FBS). حساب عدد الخلايا وضبط لتركيز نهائي من 3 × 10 7 خلايا/مل. نقل 100 ميليلتر من تعليق خلية إلى 96-فضلا عن جولة أسفل لوحة.</li>
		<li>الخلايا وصمة عار لعلامات المطلوب (انظر الجدول للمواد) لتحليل التدفق الخلوي. إضافة الأجسام المضادة مترافق fluorophore (انظر "الجدول للمواد") ضد علامات المرجوة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام. إضافة 100 ميليلتر تلطيخ المخزن المؤقت، الطرد المركزي خلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق وتجاهل المادة طافية.</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر تلطيخ المخزن المؤقت، الطرد المركزي خلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق وتجاهل المادة طافية.</li>
		المخزن المؤقت <li>ريسوسبيند بيليه في تلطيخ ميليلتر 125 والحصول على العينات باستخدام سيتوميتير تدفق استخدام إجراءات معيارية. 
		ملاحظة: صبغة الأخضر هو متحمس بليزر 488 نانومتر ويتم الكشف عن الانبعاثات مع المرشحات مزدوج اللون 505 و 530/30. صبغة اللون البرتقالي هو متحمس من 561 الكشف عن شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات بواسطة عامل تصفية مزدوج اللون 582/15.
		<ol><li>استخدام حفظ الخلايا من 2.1.8.2 للتعويض عن كل صبغة الفلورسنت. 
			ملاحظة: استخدام التعويض على أساس حبة مع fluorophores مطابقة بالإثارة وأطياف الانبعاث من الأصباغ التوسيم سيؤدي في التعويض دون المستوى الأمثل.</li>
			<li>استخدام خلايا الإدخال المحفوظة من الخطوة 2.2.2.1 لدقة تحديد النسبة الأثران المسمى خلايا الإدخال في حالة استخدام واحد أو أكثر من السكان المسمى ( الشكل 3). حساب الأنسجة الهجرة محددة استناداً إلى النسبة المسمى للخلايا غير مسمى ( الشكل 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

التحديد الكمي للهجرة الخلية المناعية يمكن إنجازه باستخدام بسيطة وسريعة فحوصات في المختبر و في فيفو. نظهر إنزيمية في المختبر من وحيدات البشرية استجابة للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 التدرج والتعزيز بالمصل. في فيفو، كان متفاوتاً المسمى المانحة مورين سبلينوسيتيس ?...

حصانة قوية يتطلب التنسيق المعقد الزماني والمكاني لعدد هائل أنواع الخلايا من أجل الاستجابة بشكل مناسب للإصابة والعدوى، وتوليد سيلفتوليرانسي. فقد اكتشفت عدة عشرات من مستقبلات تشيموكيني وعلى يغاندس المقابلة وتتسم الآليات الجزيئية تقدم بالخلايا المحددة التي يمكن أن تكون موجهة إلى أنسجة محددة في وقت محدد. وهكذا، دراسة إنزيمية والهجرة عنصرا لا غنى عنه لأبحاث علم المناعة. في الواقع، استخدمت مقايسة الموصوفة في المختبر مؤخرا كأداة لفحص لتحديد مساعد chemotactic أن يسرع به خلايا تي تجاه المستقطبات 19 و 21 ج-ج3. وغرض الأساليب الموصوفة هنا السماح بتقييمات كمية للخلايا المناعية إنزيمية في المختبر و في فيفو.
مقايسة الدائرة Boyden (الهجرة الخلية والغزو) أسلوب غير مكلفة واستنساخه والسريع لتقييم خلية الهجرة4،5. في التحليل القياسي، مجلس الشيوخ هو المصنف مع الخلايا، ويتم فصل بواسطة إدراج مسامية من النواب، التي تهاجر الخلايا. وفي الوقت المطلوب، يمكن إصلاح الخلايا التي تم ترحيلها إلى الجانب السفلي الإدراج والملون كوانتيتاتيون بالفحص المجهري الخفيفة. ومع ذلك، هذه القياسات تحد من جمع البيانات إلى نقطة نهاية واحدة، مما يحول دون جمع البيانات الحيوية ويمكن أن تتطلب التحسين واسعة النطاق لتحديد نقطة الوقت الأمثل للتحليل. هنا، يتم وصف تعديلات عدة تسمح في الوقت الحقيقي، والكمية ومتعدد القياسات من إنزيمية في المختبر.
للدراسات في فيفو ، يتم استخدام نقطة نهاية فنية، إلا وهي تراكم الخلايا في حجرة أنسجة معينة محددة. يتم إدخال الخلايا المسماة من قبل الجهات المانحة إلى الحيوانات المستفيدة من خلال نقل التبني. يمكن بعد ذلك تحديد هذه الخلايا المانحة التدفق الخلوي بعد الحصاد أنسجة المتلقي. وقدم أيضا هو استراتيجية التوسيم المشترك الذي يسمح لتحديد الاتجار بأنواع الخلايا المختلفة داخل حيوانا مستلم واحد. هذا الأسلوب يلغي الاختلاف بين الحيوانات من حقن الخلايا، وحسابات للتقلب بين الحيوان الفسيولوجية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB354597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant MCP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2e plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein animal health</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Isofluorane anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40um nylon</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml TB syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115540</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

إنزيمية هو الهجرة على طول تدرج كيميائية محددة1. هي المستقطبات chemotactic السيتوكينات التي تشجع الاتجار بالهاتف الخلوي مع الخصائص التشريحية والزمانية2. به وظيفة هامة من الخلايا الليمفاوية والخلايا المناعية الأخرى التي يمكن أن تكون الكمية المقررة في المختبر. هذه المخطوطة يصف الأساليب التي تسمح بتقييم به، سواء في المختبر و في فيفو، لأنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك خطوط الخلايا والخلايا الأصلية. في المختبر، يسمح الشكل القائم على لوحة المقارنة بين شروط متعددة في وقت واحد في الوقت الحقيقي، ويمكن أن تنجز في غضون حاء – 1-4 في المختبر فحص ظروف ويمكن التلاعب بها لإدخال الخصوم، ويضع فضلا عن تميز به من تشيموكينيسيس، وحركة عشوائية. في فيفو الاتجار التقييمات، يمكن تسميته بالأصباغ الفلورية متعددة الخلايا المناعية والمستخدمة لنقل التبني. العلامات التفضيلية للخلايا يسمح للخلايا المختلطة السكان الأخذ في الحيوان نفسه، وبالتالي تقليل التباين وتقليل عدد الحيوانات اللازمة لتجربة تعمل بشكل ملائم. الهجرة في الأنسجة اللمفاوية تحدث في أقل من 1 ساعة، ويمكن أخذ عينات متعددة الأنسجة المقصورات. التدفق الخلوي عقب الحصاد الأنسجة يسمح بإجراء تحليل سريع والكمية لأنماط هجرة العديد من أنواع الخلايا.

عند استخدام صبغة كالسين-صباحا، سيؤكد التفتيش البصري لخلايا امتصاص التسمية (الشكل 1). سوف تتبع القراءات الفلورسنت الآلي الهجرة كخلايا العبور على الجانب السفلي من الإدراج على مر الزمن. هذه البيانات تظهر بوضوح تنظيم دورات تعريفية للهجرة الخلية نحو العملية ا...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo at JoVE.com

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

التحديد الكمي الوحيدات البشرية إنزيمية في المختبر واللمفاويات مورين الاتجار في فيفو

بروتوكولات للتقييم الكمي اللمفاويات إنزيمية والهجرة أدوات هامة لبحوث علم المناعة. ويرد هنا، بروتوكولا في المختبر أن التصاريح في الوقت الحقيقي، متعدد التقييم للهجرة الخلية، وكذلك تكميلية في فيفو تقنية تمكينية تتبع الخلايا الأصلية للطحال.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K Views.  The Rockefeller University. بروتوكولات للتقييم الكمي اللمفاويات إنزيمية والهجرة أدوات هامة لبحوث علم المناعة. ويرد هنا، بروتوكولا في المختبر أن التصاريح في الوقت الحقيقي، متعدد التقييم للهجرة الخلية، وكذلك تكميلية في فيفو تقنية تمكينية تتبع الخلايا الأصلية للطحال.

Video: Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

و<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك عدوى نموذج لدراسة<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; زراعة الخلايا

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

الفئران اللمفاويات وسمها من قبل<sup&gt; 64</sup&gt; النحاس والأجسام المضادة مستقبلات استهداف ل<em&gt; في فيفو</em&gt; الاتجار خلية بواسطة PET / ط م

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

الدراسة المتزامنة لتجنيد الوحيدات الفئات السكانية الفرعية تحت التدفق في الأنابيب

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.