This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

1. إعداد طاف لفحصها لآخر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 0.5 ملغ / مل محلول المخزون من ميتوميسين C عن طريق إذابة كمية مناسبة إلى العقيمة 0.1 M MgSO 4 عازلة (على سبيل المثال 1 ملغ ميتوميسين C / 2 مل العازلة). الأسهم تخزين عند 4 درجات مئوية في ضوء حاوية المحمية (ميتوميسين C خفيف الحساسة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح مستعمرة واحدة من P. syringae إلى 3 مل من الملك B المتوسط (KB) مرق 14. احتضان أكثر من ليلة مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة (21-25 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، يخفف من ثقافة مرق 1/100 إلى 3 مل من مرق KB جديدة. احتضان لمدة 3-4 ساعة مع اهتزاز عند درجة حرارة الغرفة. إضافة ميتوميسين C (0.5 ميكروغرام / مل، وتركيز النهائي). احتضان الثقافة خلال الليل مع اهتزاز عند درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: ميتوميسين C يسبب مزدوجة فواصل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل، وبالتالي تحفيز استجابة SOS الخلية، مما يؤدي إلى إنتاج كل من الجراثيم وbacteriocins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه 1-2 مل ميتوميسين C الناجم عن الثقافات عن طريق الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 5 دقائق في مقعد كبار microcentrifuge ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وتعقيم supernatants ثقافة إما عن طريق تمرير طاف من خلال 0.22 ميكرون مرشح حجم المسام أو عن طريق معالجة طاف مع الكلوروفورم (100 الكلوروفورم ميكرولتر لكل 1 مل طاف). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام الكلوروفورم، ودوامة الخليط لمدة 15 ثانية، والسماح يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. بعد الحضانة، وأجهزة الطرد المركزي الخليط في 20000 x ج لمدة 5 دقائق. ملاحظة: الكلوروفورم يقتل خلايا بكفاءة عن طريق الانحلال أغشيتها. الاستفادة من استخدام الكلوروفورم على مرشح التعقيم هو أنه أرخص وأسهل لتوسيع نطاق حتى إذا تجهيز العديد من (&gt; 20) عينات في وقت واحد. قد يكون هناك احتمال أن يكون النشاط القتل نظرا فقدت بعد العلاج الكلوروفورم نتيجة للتجزؤ إلى المرحلة العضوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة، المرحلة المائية العليا باستخدام الماصة 1 مل إلى الطازجة والمعقمة 1.5 أو 2.0 ملmicrofuge أنبوب. يجب الحرص على عدم نقل أي من طبقة الكلوروفورم الدنيا (فمن الأفضل لإزالة أقل من المرحلة المائية لتجنب المرحل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان طاف نقل لم يسبق لهم اللعب في غطاء الدخان للسماح للالكلوروفورم المتبقية لتتبخر (عدة ساعات). متجر supernatants في 4 درجات مئوية. </li></ol></li></ol> 2. فصل وتركيز عالية الوزن الجزيئي للجراثيم المركبات التي البولي ايثيلين جلايكول (PEG) الهطول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لطاف معقم، إضافة كلوريد الصوديوم وPEG 8000 لتركيزات النهائي 1 م و 10٪ على التوالي. عكس مرارا العينة حتى يتم حل كل من كلوريد الصوديوم وPEG تماما. احتضان العينات في حمام الثلج لمدة 1 ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. ينبغي أن تشكل بيليه في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. صب وطاف و resuspend بيليه في حجم المطلوب (مثل 1/10 أو 1/100 من المجلد طاف الأصليأوميا) من العازلة (10 ملي تريس، 10 ملي MgSO 4، ودرجة الحموضة 7.0) من قبل pipetting المتكررة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PEG المتبقية من قبل اثنين من قلع متتابعة مع حجم مساو من كلوروفورم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الكلوروفورم مع بيليه معلق ودوامة لمدة 10 إلى 15 ثانية، ثم الطرد المركزي الخليط في 20000 x ج لمدة 5 دقائق. نقل، المرحلة المائية العليا لأنبوب microfuge جديدة. كرر هذا الاستخلاص حتى بدون واجهة بيضاء بين المرحلة المائية والعضوية مرئيا (مجموع عادة 2 الاستخراج). السماح الكلوروفورم المتبقية لتتبخر من supernatants المستخرج في غطاء الدخان. </li></ol></li></ol> 3. إعداد تراكب واختبار Supernatants لآخر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح مستعمرة واحدة من سلالة P. syringae لفحصها للحساسية إلى 3 مل من كيلوبايت، احتضان أكثر من ليلة مع اهتزاز عند درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، والعودة إلى إضعاف ثقافة 1/100 إلى KB جديدة. احتضان 3-4 ساعة مع اهتزاز عند من درجات الحرارة الغرفةإعادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعقيم أجار المياه من خلال التعقيم تعليق ،35-،7٪ (ث / ت) أجار في الماء عالى النقاء. ملاحظة: مخزون أجار المياه الغازية يمكن ذابت في الميكروويف وإعادة استخدامها مرارا وتكرارا، لا يحتاج إلى أن تكون مستعدة لكل تجربة تراكب جديدة. إذا تم استخدامها أجار المياه، فمن الأهمية بمكان لضمان ذاب تماما بعد الفرن. إذا لم يحدث ذلك فإن التراكب على نسيج محبب على ترسيخ شأنها أن تجعل التفسير صعبا. إذا حدث هذا، تذوب أجار لعدة دقائق وقتا أطول في الميكروويف من القيام به سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على أجار لينة المنصهر في 60 ° C حمام الماء قبل استخدامها. باستخدام الماصة المصلية العقيمة، ونقل 3 مل من أجار لينة لأنبوب الثقافة العقيمة. إعادة أنبوب الثقافة لحمام الماء للحفاظ على في حالة منصهرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب تراكب، لأول مرة السماح للأجار المنصهر لتبرد (يجب أن يشعر دافئ وليس ساخنا للمس)، ولكن لا تسمح لترسيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء العقيمة، تطعيم 100 ميكرولتر منثقافة اختبار الإجهاد في أجار لينة ودوامة لخلط. تدوير الثقافة باليد لمدة 10-15 ثانية، ثم صب على قاع أجار (KB أجار). إمالة لوحة في كل الاتجاهات لضمان أجار لينة يغطي بالتساوي آغار أسفل. ملاحظة: أجار أسفل يمكن أن يكون أي عزز (1.5٪ أجار) المتوسطة التي سلالة اختبار ينمو بقوة. ل100 مم طبق بيتري القياسية، استخدم ~ 20 مل ذابت المتوسطة. آغار أسفل يمكن إعداد عدة أسابيع قبل الموعد المحدد (إذا حافظت على 4 درجات مئوية دون تجفيف) أو يمكن أن تكون على استعداد في نفس اليوم. إذا أعدت في نفس يوم إجراء تراكب، فمن الأفضل أن تفعل قبل ذلك إلى الخطوة 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحة والسماح لها 20-30 دقيقة ليصلب. يجب الحرص على عدم تعكير صفو لوحة في حين ترسيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة عزز، بقعة 2-5 ميكرولتر من طاف (ولدت في المادتين 1 و 2 أعلاه) على التراكب. السماح لوحات لاحتضان أكثر من ليلة في درجة حرارة الغرفة. مراقبة ونتائج قياسية في صباح اليوم التالي. ملاحظة: إنهقد تكون مفيدة لأداء وبقعة من التخفيف المتسلسل من طاف. هذا وسوف تسمح للباحثين للتمييز بين الجراثيم والنشاط المقاصة مبيد جرثومي. في هذه الحالة، فمن المستحسن لأداء 1: 5 أو 1:10 التخفيفات. </li></ol>

<ol>
	<li>Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriocins+and+their+position+in+the+next+wave+of+conventional+antibiotics.">Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics.</a> Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).</li><li>Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+Predictive+Understanding+of+Earth's+Microbiomes+to+Address+21st+Century+Challenges.">Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges.</a> MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Michel-Briand, Y., Baysse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pyocins+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The pyocins of Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).</li><li>Ghequire, M. G. K., De Mot, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomally+encoded+antibacterial+proteins+and+peptides+from+Pseudomonas.">Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas.</a> FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).</li><li>Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicin+Biology.">Colicin Biology.</a> Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).</li><li>Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+Microbial+Invasions:+Amplification+Allows+Virus+Carriers+to+Invade+More+Rapidly+When+Rare.">Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare.</a> Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).</li><li>Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crystal+Structure+of+the+Lipid+II-degrading+Bacteriocin+Syringacin+M+Suggests+Unexpected+Evolutionary+Relationships+between+Colicin+M-like+Bacteriocins.">The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins.</a> J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).</li><li>Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Co-Option+of+a+Tailed+Bacteriophage+into+a+Killing+Complex+in+Pseudomonas.">Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas.</a> MBio. 6 (4), (2015).</li><li>Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytotoxic+properties+of+Pseudomonas+syringae+pv.+syringae+toxins.">Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).</li><li>Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+Genomics+of+Pseudomonas+syringae.">Ecological Genomics of Pseudomonas syringae.</a> Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).</li><li>Gratia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+Relationships+between+Lysogenic+Bacteria+and+Particles+of+Bacteriophage.">Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage.</a> Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).</li><li>Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diversity+of+Bacteriocins+in+Gram-Positive+Bacteria+.">The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria .</a> Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).</li><li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces.">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

تقنية تراكب لينة أجار هو موضح هنا تم تطبيق على نطاق واسع لعقود عديدة من قبل الباحثين المهتمين في البكتيريا أو bacteriocins. الفوائد الرئيسية لهذا النهج هي أنه بسيط ورخيص وسهل نسبيا لتفسير. من خلال الجمع بين تراكب لينة أجار مع PEG هطول الأمطار والتخفيف المتسلسل، العوامل المضادة للجراثيم يمكن فصلها إلى ارتفاع مقابل انخفاض كلاء الوزن الجزيئي، وتنسخي مقابل غير تنسخي وكلاء (أي الجراثيم مقابل tailocin، على التوالي). وأخيرا، دمج التلاعب الجيني المستهدفة (الحذف وتكامل) من مبيد جرثومي المفترضة أو مواضع طليعة العاثية يمكن ترسيخ هوية مركب معاد معين. وقد استخدمنا هذه الطريقة مؤخرا لوصف جديد الجراثيم المستمدة من مبيد جرثومي واسع الإنتشار بين الزائفة syringae سلالات 9. وسائل الإعلام نمو والشروط المشار إليها في هذا العمل بروتوكول جيدا لالزائفة سيسوف ringae ومن المرجح تكفي لالجراثيم سلبية الغرام الأخرى التي تنمو بقوة في ظل هذه الظروف. ومع ذلك، فإن الباحثين باستخدام هذا الأسلوب يريدون تحقيق أفضل توقيت، مستنبت، طريقة الاستقراء، ودرجة حرارة الحضانة لنظامهم. وتشمل المعلمات الحرجة حمل الثقافة المنتجة بينما في مرحلة النمو لوغاريتمي، وكذلك بذر تراكب لينة أجار مع ما يكفي من ثقافة مرحلة لوغاريتمي لضمان توزيع البكتيرية موحد، ولكن ليس ثقافة المفرطة، والتي سوف تحجب مناطق المقاصة المحتملة. هناك العديد من bacteriocins التي لا يسببها كجزء من استجابة SOS، بل وبفعل من خلال أنظمة الاستشعار عن النصاب القائم على الببتيد (خاصة bacteriocins إيجابية الجرام 15)، وبالتالي، الباحث قد ترغب في فحص عدة طرق تحريض مختلفة (مثل تعديل المحتوى الغذائي للحمل المتوسطة، أو السماح للحضانة طويلة من سلالة إنتاج). عند استخدامهذه التقنية، وتراكب لينة أجار يجب أن ذابت تماما والحفاظ على 55-60 درجة مئوية قبل إضافة سلالة البذر. لقد كان لدينا العديد من التجارب حيث لم يكن ذابت أجار لينة تماما (على الرغم بصريا يبدو أن يكون) وأسفرت عن تراكب مع ظهور محبب. النتائج من تراكب محببة يمكن أن تكون للتفسير عموما، ولكن هذا يعتمد على قوة تثبيط (تثبيط الأضعف سيكون من الصعب مراقبة). A، يتيه متغير النهائي في الاعتبار عند استخدام هذه التقنية هو أن يسمح للحرارة أجار المنصهر الوقت الكافي لتبرد قبل التلقيح مع سلالة البذر، وذلك لتجنب قتل سلالة البذر. لتجنب هذه المشكلة، ونحن ضمان أجار لينة دافئة، ولكن ليست ساخنة، للمس. على طول هذه الخطوط، لاحظنا أيضا أنه إذا نعطي وقتا كافيا للثقافة البذر ليتأقلم مع أجار المنصهر، وذلك قبل صب تراكب، نستعيد الفقراء عموما ز البكتيريةrowth، مما يجعل تفسير تثبيط محددة من الصعب أو من المستحيل تفسير. هذا هو السبب في أننا نسمح 10-15 ثانية إضافية من الحضانة بين vortexing لوسكب التراكب. المفاضلة بين الحفاظ على أجار في حالة منصهرة تماما (سخونة أفضل) ولكن غير مميتة للسلالة البذر (سخونة ليست أفضل) هي واحدة من شأنها أن تحتاج المرجح أن يحددها الباحث من خلال التجربة والخطأ. إذا تم استخدام خطوة هطول PEG، سيكون من المفيد لتشمل مراقبة سلبية حيث تتم معالجتها وسيلة مرق عقيم مماثل لطاف الثقافة. وسوف يضمن هذا مما أسفر عن مقتل النشاط ليس نتيجة PEG المتبقية أو الكلوروفورم داخل طاف العينة. كما تميل كل من البكتيريا وbacteriocins أن تكون محددة للغاية، فإنه ليس من غير المألوف لمواجهة أي نشاط قتل على ما يبدو مع مجموعة معينة من السلالات. هذا يمكن أن تنجم عن مجموعة متنوعة من سلالة محددة إعادةآليات مقاومة لأ، واحد هو أن سلالة اختبار إما يفتقر أو لديه نسخة غير المعترف بها من مستقبلات اللازمة لاستهداف من قبل مبيد جرثومي معين أو الجراثيم. طريقة بديلة، وقد وصفت طريقة الفرز مبيد جرثومي بواسطة كاواي وآخرون. ، لكنها تعاني من عيوب ولم يعتمد على نطاق واسع (16). على وجه التحديد، وهذا الأسلوب يتطلب مراقبة عينات مرق في فترات زمنية يمكن أن تكون مرهقة، ولا تسمح للتمييز بين الأنشطة قتل عاثية المشتقة ومبيد جرثومي المشتقة. القيود الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه ليس مناسبة تماما للكائنات التي لا تنمو بقوة (وبالتالي سوف تفتقر مناطق المقاصة ملحوظ بسهولة) أو أن prophages الميناء أو bacteriocins التي لا تنتج بقوة تحت ظروف المختبر. التكيف هذه التقنية للكشف عن bacteriocins المنتجة في عينات بيئية من شأنه أن كلا توسيع الأداة المساعدةمن هذه التقنية وتسهيل مزيد من التبصر في دور bacteriocins داخل البيئات الطبيعية.

في الآونة الأخيرة، كان هناك اهتمام كبير في تعميق فهمنا لعلم البيئة الميكروبية (وخاصة microbiomes من بيئات مختلفة)، وكذلك المركبات المضادة للبكتيريا جديدة لاستخدامها في مكافحة الجراثيم المقاومة للمضادات الحيوية 1،2. وموضوع الربط بين هذه المصالح هو فهم التفاعلات العدائية بين السلالات البكتيرية في بيئتها الطبيعية. هناك العديد من الطرق التي البكتيريا تقلد المنافسين 3. Bacteriocins، مجموعة متنوعة من البروتينية، ومركبات مضادة للجراثيم، منذ فترة طويلة ودرس لدورهم في التوسط العداء interbacterial، مع اثنين من الأنواع الأكثر درس يجري الزائفة الزنجارية 4،5 والقولونية 6، مسببات الأمراض البشرية الهامة. بالإضافة إلى bacteriocins، يمكن prophages يسببها أيضا بمثابة وكلاء anticompetitor، والسماح لسلالة لغزو إلى مكانة التي استعمرت بالفعل 7. الزائفة الصورةyringae هو الممرض النباتات المعروفة لإنتاج مجموعة من العوامل المضادة للجراثيم، بما في ذلك bacteriocins واحدة بروتين 8، عاثية bacteriocins المستمدة ذيل 9 (tailocins تسميته)، وكذلك المركبات الثانوية غير البروتينية 10. في الآونة الأخيرة كان هناك اهتمام في فهم كيفية تأثير هذه مضادات الميكروبات في البيئة من هذا الكائن الحي، وكذلك الكيفية التي يمكن تسخيرها للسيطرة على الأمراض النباتية 11. وهناك طريقة تستخدم على نطاق واسع لدراسة كل من bacteriocins والجراثيم هو الأسلوب تراكب الناعمة أجار. وقد وصفت هذه الطريقة لأول مرة على سبيل الهبة في عام 1936 للمساعدة في تعداد عاثية 12،13. نحن هنا وصف تطبيق طريقة تراكب لينة أجار، بالاشتراك مع التلاعب الجيني المستهدف والبولي ايثيلين جلايكول (PEG) هطول الأمطار، في التمييز بين ثلاثة مضادات حيوية مختلفة (أ الجراثيم، عالية الوزن الجزيئي جرثومةeriocin، وانخفاض الوزن الجزيئي مبيد جرثومي) التي تنتجها السلالة البكتيرية واحد. الاستفادة من هذا النهج هو أنه بسيط نسبيا ورخيصة، وهذا هو السبب، على الرغم من كونها بالتأكيد &quot;التكنولوجيا المنخفضة، لا تزال تستخدم على نطاق واسع.

<table><tbody><tr><td>Mitomycin C</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3514</td><td>Carcinogenic. use appropriate PPE (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34854</td><td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol (PEG)</td><td>Amresco</td><td>0159</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological grade agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td></td></tr></tbody></table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

وقد تم تطوير تقنية تراكب لينة أجار أصلا منذ أكثر من 70 عاما، واستخدمت على نطاق واسع في العديد من المجالات البحثية الميكروبيولوجي، بما في ذلك العمل مع البكتيريا وbacteriocins، وكلاء المضادة للبكتيريا البروتينية. هذا النهج غير مكلفة نسبيا، مع الحد الأدنى من الاحتياجات من الموارد. وتتكون هذه التقنية من اكتشاف طاف من سلالة المانحة (يحتمل أن تأوي مركب سام (ق)) على تراكب أجار لينة طدت التي بذرت مع سلالة بكتيرية اختبار (يحتمل أن تكون حساسة لمركب سام (ق)). نحن تستخدم هذه التقنية لفحص مكتبة الزائفة syringae سلالات عن مقتل ضمن النوع. من خلال الجمع بين هذا النهج مع خطوة هطول الأمطار والحذف الجينات المستهدفة، المركبات السامة المتعددة التي تنتجها نفس السلالة يمكن أن تكون متباينة. وكلاء عدائية اثنين تعافى عادة باستخدام هذه التقنية والبكتيريا وbacteriocins. يمكن التفرقة بين هذه العميلين باستخداماختبارين إضافية بسيطة. سوف يؤدون التخفيف المتسلسل على طاف تحتوي على الجراثيم يؤدي في لويحات الفردية أصبحت أقل في عدد بمزيد من التخفيف، في حين التخفيف المتسلسل من طاف تحتوي على مبيد جرثومي سيؤدي منطقة المقاصة أن يصبح موحد أكثر عكر بمزيد من التخفيف. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجراثيم تنتج منطقة المقاصة عندما رصدت على تراكب أجار لينة جديدة المصنف مع نفس السلالة، في حين سوف مبيد جرثومي لا تنتج منطقة المقاصة عند نقلها إلى الحديقة أجار لينة جديدة، نظرا لتخفيف من مبيد جرثومي.

مزيج من تراكب أجار لينة وPEG هطول الأمطار يمكن استخدامها لتحديد وتوصيف العوامل المضادة للجراثيم مختلفة التي تنتجها نفس السلالة. ويبين الشكل 1 سلالتين من P. syringae (A و B) التي تحول دون سلالة الثالث من نفس النوع. سلالتين، ومع ذلك، يتم تثبيط من قبل bacteriocins مختلفة. منطقة المقاصة على سلالة والمعارض حافة حادة، في حين أن منطقة المقاصة على سلالة B أكبر، ويسلك الحدود غير حاد. التلاعب الجيني داخل السلالة المنتجة للأن تعطيل تحديدا إما tailocin (tailocin ناقص) أو منخفضة الوزن الجزيئي مبيد جرثومي (ناقص مبيد جرثومي) تؤكد أن سلالات ألف وباء حساسة لbacteriocins متميزة. ويبين الشكل 2 أن قتل بوساطة الجراثيم يمكن تمييزها عن مضادات الميكروبات الأخرى غير تنسخي بمقارنة سلسلة التخفيف. لأن كلا bacteriocins وطليعة العاثية يمكن الناجم عن ميتوميسين العلاج C، يمكن أن أنشطة هذه العميلين تشبه بعضها البعض (وخاصة إذا كان فج تنشيط وفيرة). في حالة تبادل المعلومات بوساطة الجراثيم، والتخفيف من طاف حل لويحات الفردية (مناطق المقاصة) في حين أن المقاصة مبيد جرثومي بوساطة لن تحل في مثل هذه اللوحات. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> الشكل 1: تمييز المظهري من العوامل المضادة للجراثيم متعددة تنتجها نفس السلالة. سلالة A غير حساس لارتفاع مبيد جرثومي الوزن الجزيئي (tailocin) ولكن ليس بديلا منخفض الوزن الجزيئي مبيد جرثومي، كما يتضح من عدم وجود تطهير في سلالة نقص tailocin، ولكن ليس سلالة نقص مبيد جرثومي. وفي المقابل، سلالة B غير حساس للtailocin، ولكن حساسية لانخفاض الوزن الجزيئي مبيد جرثومي. وtailocin هو efficتعافى iently التالية PEG هطول الأمطار، في حين انخفضت bacteriocins الوزن الجزيئي ليست كذلك. WT = النوع البري. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> الشكل 2: التمييز بين مضادات الميكروبات غير تنسخي والبكتيريا. (أ) التخفيف من عيار عال من النتائج البكتيريا في لوحات الفردية التي تصبح أقل عددا (ارتفاع عيار أعلى، وانخفاض عيار أسفل). (ب) التخفيف من النتائج bacteriocins في أقل موحد المقاصة أن لا حل في لويحات الفردية. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds at JoVE.com

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

استخدام تقنية تراكب لينة أجار للكشف عن المركبات المثبطة إنتاج البكتريا

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.1K Views.  University of Arizona. We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria. 

Video: Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

باستخدام تراكب الفحص لقياس نوعيا الإنتاج الجرثومي من والحساسية للالرئوية Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

منهجيات لدراسة<em&gt; B. الرقيقة</em&gt; الأغشية الحيوية نموذجا للتميز الصغيرة جزيء بيوفيلم المانعون

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

مختبر تقنيات العقيم: طرق تصفيح

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biology

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

فحص عالي الإنتاجية للمركبات الكيميائية لتوضيح آثارها على الثبات البكتيري

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

نمو المؤجل تثبيط الفحص لتحديد تأثير مضادات الميكروبات المستمدة البكتيريا على المنافسة

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

وهناك طريقة لتقييم بكتريوسين الآثار على الأمعاء الدقيقة من الفئران

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Soft Agar Colony Formation Assay: A Method to Test Effects of Novel Compounds on Cancer Cell Proliferation

Source: Horibata A. et. al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52727/utilization-soft-agar-colony-formation-assay-to-identify-inhibitors"> Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video describes a soft agar colony formation assay to test the effects of a PADI enzyme inhibitor and BB-Cl-amidine on breast cancer tumorigenicity in vitro. This assay also enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations.

مقايسة تكوين مستعمرة أجار الناعمة: طريقة لاختبار تأثيرات المركبات الجديدة على تكاثر الخلايا السرطانية

Source: Horibata A. et. al.,  Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells. J. Vis. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

Breast Cancer

In vitro studies

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

Source: Dalecki, A. G., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53925">Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates an assay for screening antimicrobial compounds that efficiently eliminate biofilms using a peg-plate. The methodology monitors the biofilm&#39;s metabolic state after treatment with antimicrobial compounds, facilitating the determination of the minimum biofilm eradication concentration.

اختبار الأغشية الحيوية للوحة الوتد لفحص العوامل المضادة للبكتيريا

1. Biofilm Initiation

	Grow a culture of biofilm-producing organisms in a nutrient-rich medium. Inoculate&#160;Staphylococcus aureus&#160;strain Newman ...

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Deferred Growth Inhibition Assay to Evaluate the Effect of Bacteria-Derived Antimicrobial Compounds

Source: Moran, J. C. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54437">Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video showcases the deferred growth inhibition assay, used to investigate how antimicrobial compounds produced by one type of bacteria affect another competing bacterial strain.

اختبار تثبيط النمو المؤجل لتقييم تأثير المركبات المضادة للميكروبات المشتقة من البكتيريا

The following method is adapted&#160;to test competitor strains with inhibitor-producing strains.
NOTE: This protocol involves aerosol generation with ...

استخدام تقنية تراكب لينة أجار للكشف عن المركبات المثبطة إنتاج البكتريا

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video