The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت في هذه الدراسة من قبل جامعة كايو المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC - عدد موافقة: 09221) واتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية في التجارب على الحيوانات في جامعة كيو لاستخدام الحيوانات في مجال البحوث. تم عزل العينات البشرية من جيفة التبرع بها لقسم التشريح، جامعة كيو كلية الطب، واستخدمت وفقا للوائح المؤسسية. 1. عزل السمعية بولا وكبسولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران في وعاء يحتوي على منصة فوق المناشف الورقية غارقة في الأيزوفلورين أو سيفوفلوران حتى تتوقف تهوية الجهاز التنفسي لأكثر من دقائق ثم قم بإجراء خلع عنق الرحم. كن حذرا لتجنب الاتصال المباشر من الفئران مع مناشف ورقية مبللة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق عرضي صغير في الجانب الظهري من الرقبة وسحب الجلد بعيدا نحو الرأس والذيل باستخدام كلتا اليدين لفضح الأساسي مو الرقبةالأنسجة scle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الفئران في منطقة عنق الرحم باستخدام 14 سم مقص جراحي حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر الجلد تماما نحو الأنف. قطع جميع الجلد جنبا إلى جنب مع خطم والقواطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج مقص في الفم وقطع العضلات الماضغة في كلا الجانبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الفك بعناية وإزالة اللسان والفك السفلي معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص حاد، الجمجمة تقسيم وقاعدة الجمجمة إلى نصفين على طول الطائرة السهمي النصفي (الشكل 1A، B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، إزالة نصفي الكرة المخية والمخيخ وجذع الدماغ. وتقع الفقاعة السمعية وكبسولة الأفقي إلى المخيخ وجذع الدماغ. لاحظ أن الفقاعة السمعية هي أبعد الجانبية للكبسولة السمعية (الشكل 1C، D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج الفقاعة وكبسولة مع المحيط عظم الجمجمة (الشكل 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينة إلى صحن يحتوي مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uالتانجو تشريح المجهر مجهر، واستخدام الملقط لسحب بصرف النظر العظام ومقص المحيطة لقطع الحدود خففت حول الفقاعة وكبسولة (الشكل 1F). العظام المحيطة إزالتها هي قاعدي قذالي (الحدود بطني)، خارج القذالي (-ventro الخلفي الحدود)، فوق القذال (الحدود خلفي)، الجداري، الجدارية (الحدود ظهري)، صدفي (ظهراني الأمامي الحدود)، جناحي وتدي (الحدود الأمامي)، والعظم القاعدي الوتدي (الحدود انتيرو بطني) العظام. لاحظ أن عملية إبري الشكل (SP)، الذي يدعم افتتاح الطبلي من النفير 41، يختلف عن عملية الإبري من العظم الصدغي. </li></ol> 2. عزل السمعية عظيمات: المطرقة، السندان وعظمة الركاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المطرقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام كل من مقص صغير وملقط، إزالة جزء من الخارجي الجانبي القناة السمعية إلى الطبلي تلم بحيث الغشاء الطبلي مرئيا (الشكل 2A، B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جزء من الغشاء الطبلي والعظم الطبلي بالقرب من malleal الناتئ القصير (نتوء الدويري، انظر مناقشة)، سواء على بطني (منقط) والخلفي (#) الجدران (الشكل 2C). وينبغي الآن يتعرض المطرقة والموترة للطبلة العضلات (الشكل 2D، E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع المطرقة (الشكل 2F) وقطع العضلة الموترة للطبلة مع حافة مشطوف من 27 إبرة G (الشكل 2G). لاحظ أن المقبض malleal تعلق بحزم لغشاء الطبل، كما هو الحال في غيرها من الثدييات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الغشاء الطبلي بعناية من المقبض، الذي لا يزال هشا. إزالة العظم الطبلي للكشف عن عظيمات السمع الثلاث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلخل في المطرقة من سندان في مفصل عظيمي (الشكل 2H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل المطرقة التي كتبها كسر عملية الأمامية في goniale. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سندان وعظمة الركاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل رانه سندان بقطع في الرباط الخلفي للسندان في الساق قصيرة (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الركابي بقطع الشريان الركابي قرب الركابي مع حافة مشطوف من 27 إبرة G (الشكل 3B، C). إذا لزم الأمر، وقطع في وتر العضلة ركابي في عملية العضلات من الركابي مع الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال ابرة الخياطة (أو دبوس بمناسبة) في الثقبة المسد من الركابي ويرفع الركابي. بعد إزالة الركابي، ينبغي أن يكون فتح نافذة بيضاوية واضحة للعيان (الشكل 3D). </li></ol></li></ol> 3. تضمين من السمعية بولا وكبسولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مبنية كتل البارافين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الفقاعة وكبسولة كما هو موضح في القسم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع نهاية الأمامي من الفقاعة (عملية إبري الشكل) قبالة مع مقص، وتزج الفقاعة وكبسولة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني في 4 درجاتC، والسماح تثبيتي للدخول في الفقاعة. إذا يصبح الهواء المحبوس في الفقاعة، إزالته مع الإبر والمحاقن. ترك الفقاعة وكبسولة في تثبيتي في 4 درجات CO / N على محور دوار أنبوب. تحذير: PFA غير سامة، ويجب أن يتم التعامل معها بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يزيل الكلس الفقاعة وكبسولة لمدة أسبوع في 4 درجات مئوية 10٪ ethylenediaminetetraacetic حامض الصوديوم الملح ثنائي الهيدرات (EDTA-2NA)، و 100 قاعدة ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.0، في أنبوب مل 2. تغيير المخزن المؤقت كل يوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. العينات يمكن تخزينها في 70٪ من الإيثانول في الماء عند 4 درجات مئوية. اختياريا، ونقل إلى 70٪ من الإيثانول من خلال سلسلة الكحول متدرج (30٪، 50٪، 70٪ في الماء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على معالج الأنسجة، ويذوى العينات في سلسلة متدرجة من الحلول الإيثانول (70٪، 2X 95٪، 3X 100٪، كل ح 1)، واضحة في الزيلين (4X، كل ح 1 في 40 درجة مئوية)، والتسلل العينات مع المنصهر شمع البارافين 42. اختياريا، زيلين البديل مع clearin الأنسجة التجاريز حل (مثل HISTO-واضح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريغ عينات من المعالج، وإزالتها من الكاسيتات الخاصة بهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الأنسجة تضمين نظام وحدة التحكم، مكان. نماذج في قوالب مليئة شمع البارافين المنصهر. انتقل إلى تضمينها (القسم 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مبنية بنات المجمدة (طريقة فيلم كاواموتو في) 43 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الفقاعة وكبسولة كما هو موضح في القسم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع نهاية الأمامي من الفقاعة (عملية إبري الشكل) قبالة مع مقص، وتزج الفقاعة وكبسولة في تثبيتي (2٪ أو 1٪ PFA بدلا من 4٪ في برنامج تلفزيوني للحفاظ على استضداد) في 4 درجات مئوية. إذا تم المحاصرين الهواء في الفقاعة، إزالته باستخدام الإبر والمحاقن. ترك الفقاعة وكبسولة في تثبيتي في 4 درجات CO / N على محور دوار أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الفقاعة وكبسولة بسرعة في برنامج تلفزيوني وتزج فورا في السائل مركب تضمين البرد في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هام: إزالة فقاعات الهواء وجدت في منتصفوالأذن الخارجي من خلال التطلع بواسطة إبرة، وذلك بإضافة مجمع تضمين بالملقط. انتقل إلى تضمينها (القسم 4). </li></ol></li></ol> 4. توجيه العينة وتضمينها يجب أن يكون ترتيب الفقاعة كلها، وكبسولة في اتجاه معين خلال تضمين لخفض أقسام المرجوة: ملاحظة. وتستخدم الإجراءات المبينة أدناه لقسم المطرقة في مختلف التوجهات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطولي (مجاور للسهمي) باجتزاء من المطرقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجانب الوحشي من الفقاعة أو الصماخ السمعي الخارجي عليها في البارافين الدافئة (أو مركب تضمين البرد). ضبط اتجاه بحيث الرقبة ومستعرضة الصفيحة من المطرقة موازية لأسفل الأفقي للطبق التضمين (الشكل 4A - C). لاحظ أن الغشاء الطبلي يميل بزاوية مقدارها حوالي 30 درجة إلى رأسي في الرأس الماوس (الشكل 4A، الشكل 59 في كامبن <suص&gt; 44). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باجتزاء الأفقي للالمطرقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قمة ظهري أفقيا في البارافين الدافئة (أو مركب تضمين البرد). ضبط اتجاه الفقاعة وكبسولة بحيث الرقبة ومستعرضة الصفيحة من المطرقة هي عمودي إلى أسفل الطبق التضمين (الشكل 4D - F). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باجتزاء الأمامي (المقاطع العرضية) من قبضة القص والطبلي غشاء 5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المقبض malleal في البارافين الدافئة (أو مركب تضمين البرد) بحيث يكون عموديا إلى أسفل الطبق تضمين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهدئة كتلة لدرجات الحرارة المناسبة لتصلب شمع البارافين على الأنسجة تضمين نظام وحدة (بدلا من ذلك، استخدم مركب تضمين البرد في الجليد حمام جاف / الهكسان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الأنسجة عملية وقطع المقاطع باستخدام الإجراءات الروتينية. على سبيل المثال، أقسام صمة عار البارافين مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; #38؛ E)، سفرانين O (لغضروف)، أو مقاومة للطرطرات حمض الفوسفاتيز (TRAP) النشاط (لالآكلة) 3، أو عن طريق المناعية. cryosections Undecalcified هي مناسبة لوصفها العظام باستخدام fluorochromes 14، الأليزارين تلطيخ الأحمر للكالسيوم، والمناعي +42. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا، فإننا نقدم وسيلة مفيدة لعزل الفقاعة السمعية وكبسولة في الفئران بعد الولادة. قبل P12، أنسجة هشة ويمكن أن تصبح التالفة أثناء العزلة. بعد P12، الفقاعة السمعية وكبسولة يمكن عزلها عن الأنسجة المحيطة بها. تشريح الفقاعة من الرأس قبل باجتزاء ديها العديد من المزايا. أولا، التجويف ما بعد الولادة ونمو الفقاعة السمعية تحدث معظم بنشاط من P6 فصاعدا وهي كاملة من قبل P14 50. يتم استبدال الأنسجة الوسيطة بين الغشاء الطبلي وجدار القوقعة عن طريق الجو من خلال عملية التجويف. الهواء الناجم عن ذلك في تجويف الأذن الوسطى يمكن أن تعوق الاتصال بين الأنسجة والسوائل أثناء التثبيت، وزوال الكلس والتضمين. فمن الأسهل لإزالة الهواء من الفقاعة السمعية معزولة بقطع النهاية (عملية إبري الشكل) الأمامية بدلا من محاولة القيام بذلك في الفقاعة unisolated. ثانيا، توجه المطرقة (والغشاء الطبلي) ليس الرأسيفي الرأس. ولذلك فمن الأسهل إلى قسم المطرقة في الطائرات المطلوب عن طريق دمج الفقاعة السمعية معزولة وكبسولة في اتجاه معين. مرة واحدة معزولة، الفقاعة السمعية وكبسولات مفيدة للعديد من التحليلات. على سبيل المثال، يمكن أن ارتفاع قرار الأشعة السينية الصغرى CT كشف العظام المجهرية التشكل مثل الشعيرات الدموية المكونة للعظم في المطرقة 14. وstereofluorescence تشريح المجهر هو أداة قوية لتصور الهياكل في تقييم الفئران مراسل معربا عن البروتينات الفلورية في الوسط أو الداخلية الأذن 33. بالإضافة إلى ذلك، مختلف في الجسم الحي أو خارج الجسم الحي مضان طرق وضع العلامات وكله جبل كشف المناعي يمكن الاضطلاع بها. ضوء ورقة مضان المجهر مفيد أيضا لتحليل ثلاثي الأبعاد-51. وإن لم يكن هو موضح هنا، والهياكل التشريحية المختلفة المرتبطة الفقاعة السمعية وكبسولة مثل الأعصاب الطرفية، والأوعية الدموية، والغشاء الطبلي في الأذن الوسطى كما يمكن تقييمها باستخدام هذا البروتوكول. لاحظ أن باجتزاء البارافين يتطلب زوال الكلس للأنسجة العظام قبل التضمين، وبالتالي لا يسمح تحليل تمعدن. على النقيض من ذلك، فإن طريقة فيلم كاواموتو 43 المستخدمة في إعداد أقسام المجمدة يمكن أن يؤديها من دون زوال الكلس ومناسبة للدراسات تمعدن استخدام في تقنيات العظام وضع العلامات الجسم الحي أو تلطيخ خاص مثل الصبغ الأحمر تلطيخ. ينبغي أن يكون الأمثل ظروف البرد باجتزاء .. وفقا القائم على أساس السن الماوس. على سبيل المثال، ينصح درجة حرارة أقل باردة داخل الغرفة ناظم البرد لعينات الماوس القديمة للحد من الأضرار التي لحقت أقسام. وفي الماوس، المصطلح الصحيح للنتوء بارز شبه كروية من المطرقة هو &quot;نتوء الدويري&quot;. ومع ذلك، فإن مصطلح &quot;خنصر الناتئ&quot; وقد استخدم على نطاق واسع للإشارة إلى نتوء الدويري لمزيد من اللعقدين من الزمن، وخاصة بين الماوس علماء البيولوجيا التطورية 16،20،22-25. &quot;الناتئ القصير&quot; يشير أصلا إلى عملية الجانبية (الناتئ الوحشية)، والذي يختلف من نتوء الدويري. في البشر، وهي عملية تشبه الجانبية إسقاط مخروطي طفيف تشكل الخط العام للمرفق إلى غشاء الطبل، وتمتد من قبضة القص (لم أر في الشكل 6B، عرض وسطي). في الفئران، وعملية الجانبية هي أيضا إسقاط المقبض في الطرف المقابل لبجرة 48. في الجزء الرخو من الغشاء الطبلي فوق عملية الجانبية للالمطرقة. نتوء دائري ليست واضحة في المطرقة الإنسان.

وعظيمات السمع الثلاث في الأذن الوسطى، وهي المطرقة، السندان، والركابي، تشكل سلسلة السمعية الثدييات محددة التي تنقل الصوت من الغشاء الطبلي إلى الأذن الداخلية، أو القوقعة 1،2. السمع وظيفة يمكن تقييمها في الفئران عن طريق قياس سمعي جذع الاستجابة (ABR) عتبات 3-6، واهتزاز المطرقة وراء يمكن رصدها باستخدام الليزر دوبلر Vibrometry (LDV) 7 الغشاء الطبلي. من خلال الجمع بين ABR، LDV، والقياسات تشويه المنتج Otoacoustic الانبعاثات (DPOAE)، وفقدان السمع التوصيلي يمكن أن يكون هناك تمييز من ضعف الحسي 8. هناك حاجة إلى نماذج حيوانية من الظروف الأذن، نظرا لأهمية السمع وصحة الأذن إلى رفاه المرضى من جميع الأعمار. على سبيل المثال التهاب الأذن الوسطى هو التهاب الأذن شائعة جدا ينظر في الرضع والأطفال الإنسان، والحادة، التهاب الأذن الوسطى الحاد ويمكن أن يحدث مضاعفاته إذا كان كونديلم يتم علاجه نشوئها مع مضادات الجراثيم المناسبة 9. قد تكون نماذج الماوس من التهاب الأذن الوسطى مفيدا في فهم المرضية وفي تطوير علاجات 10،11. العظيمات الفئران، التي تتشكل (باستثناء الجزء goniale من المطرقة) التي تعظم غضروفي 12،13، هي ذات أهمية كبيرة لدراسة استقلاب العظام والتشكل. أولا، صغر حجمها يسمح تحليل عالية الدقة للعظام مع السمحاق سليمة باستخدام الأشعة السينية أو المجهري مضان 14. ثانيا، الشاذة استقلاب العظام، مثل المفرط أو نقص ارتشاف العظام، أو تفاعلات ضعاف بين الخلايا العظمية 15، يمكن تحليلها كمساهم محتمل لفقدان السمع 3،4،7. وذكر الثالث، غير طبيعي التشكل عظيمات في الفئران عدة جينات ناقصة، مثل الحيوانات التي تفتقر إلى Hoxa2 16-19، 20-22 الجينة Msx1، Prrx1 23، Goosecoid(GSC) 24،25، Bapx1 13، Tshz1 26، Dusp6 (Mkp3) 27، رأس (وتد) 28، Fgfr1 29، وهرمون الغدة الدرقية مستقبلات (Thra، Thrb) 5، Bcl2 30 وغيرها 1،31، أو في الفئران overexpressing Hoxa2 32. وأخيرا، على الرغم من صغر حجمها، والهياكل المرتبطة عظيمات مثل العضلات والمفاصل 33 34،35 يمكن الوصول إليها. العظيمات الماوس هي أصغر من عظيمات الإنسان، ولكن من الجدير بالذكر أن الأذن الوسطى الماوس ليست نسخة مصغرة من نظيرتها الإنسان. على سبيل المثال، في الفئران، الشريان الركابي، الذي يمر من خلال حلقة من الركابي، استمر طوال حياته 36، في حين أنه في البشر، يختفي الشريان الركابي الجنينية أثناء الحمل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مورفولوجية المطرقة الماوس يختلف من عشرالبريد العظم البشري (أنظر الشكل 6). في الفئران، الفقاعة السمعية (طبلي) يرفق تجويف الأذن الوسطى مليئة بالهواء، في حين أنه في البشر، وخلايا الخشاء الهواء يتكون من العظام التربيقي في العظم الصدغي ويوجد في عظيمات بدلا من الفقاعة 37. في كلا النوعين، وكبسولة السمعية (الكبسولة، التي التيه العظمي) يرفق القوقعة والقنوات الهلالية في الأذن الداخلية. وقد استعرضت علم الأحياء التطوري المقارن والأذن الوسطى على نطاق واسع 38-40. بروتوكول الواردة أدناه أولا يصف كيفية تشريح خارج الفقاعة السمعية وكبسولة، والتي تتكون أساسا من الأذن الوسطى والأذن الداخلية، على التوالي. يوضح هذا البروتوكول أيضا كيفية عزل المطرقة، السندان والركابي من الفقاعة السمعية. وأخيرا، فإنه يظهر كيفية توجيه الفقاعة السمعية وكبسولة لتضمين استعدادا لباجتزاء الأنسجة من عظيمات السمع.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Tools/Equipment</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paper towel</td>
			<td>DAIO PAPER CORPORATION</td>
			<td>703347</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Jar</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">14cm surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>91400-14</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extra fine scissors-straight</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps Angled 45&#176;</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>for routine dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>for movies&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Injection needle 27G</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (1ml)</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marking Pin</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube rotator RT-50</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000165-000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:259px;">http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TC-65 Tungsten blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14021626379</td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless containers</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryofilm type IIC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silane coated slide (New Silane II)</td>
			<td>Muto Pure Chemicals</td>
			<td>511617</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue processor</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:124px;">VIP-5</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Embedding Console System</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:124px;">Tissue-Tek TEC 5&#160;</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sliding microtome for paraffin</td>
			<td>Yamato Kohki Industrial</td>
			<td>REM-710</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Path Blade+pro for hard tissue</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>PB3503C</td>
			<td>for paraffin section</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-CT</td>
			<td>RIGAKU</td>
			<td>R_mCT2</td>
			<td>http://www.rigaku.com/en</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>wako</td>
			<td>285-14</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4 12H2O</td>
			<td>wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td>wako</td>
			<td>287-21</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde(EM Grade)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>P001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA-2Na</td>
			<td>wako</td>
			<td>15111-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Super Cryoembedding Medium</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Ice</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hexane</td>
			<td>wako</td>
			<td>080-03423</td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Super Cryomouting Medium type R2</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>781001A0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histo-Clear</td>
			<td>NDS</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>340-00433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin&#160;</td>
			<td>wako</td>
			<td>131-09665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>wako</td>
			<td>051-06515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

في معظم الثدييات، عظيمات السمع في الأذن الوسطى، بما في ذلك المطرقة، السندان والركابي، هي أصغر العظام. في الفئران، وهو هيكل عظمي يسمى الفقاعة السمعية منازل للعظيمات، في حين أن كبسولة السمعية يرفق الأذن الداخلية، وهي القوقعة والقنوات الهلالية. العظيمات الفئران ضرورية لسماع وبالتالي من مصلحة كبيرة للباحثين في مجال طب الأذن والحنجرة، ولكن من عملية التمثيل الغذائي، والتنمية، وتطور وذات أهمية كبيرة لغيرها من المجالات. تغيير استقلاب العظام يمكن أن تؤثر على وظيفة السمع في فئران بالغة، ومختلف الفئران الجينات نقص تظهر التغيرات في التشكل من عظيمات السمع في الرحم. على الرغم من عظيمات السمع الفئران هي صغيرة، والتلاعب بهم ممكنا إذا كان أحد يفهم ميولهم التشريحية وهيكل 3D. هنا، نحن تصف كيفية تشريح الفقاعة السمعية وكبسولة من الفئران بعد الولادة ثم عزل عظيمات الفردية عن طريق إزالة جزء من الفقاعة. نحن أيضا مناقشة كيفية مالسرير الفقاعة وكبسولة في اتجاهات مختلفة لتوليد البارافين أو أقسام المجمدة مناسبة لإعداد المقاطع الطولية الأفقية أو الجبهي من المطرقة. وأخيرا، فإننا تعداد الاختلافات التشريحية بين الفأر والإنسان عظيمات السمع. أن هذه الأساليب يكون مفيدا في تحليل الجوانب المرضية والتنموية والتطورية للعظيمات السمع والأذن الوسطى في الفئران.

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لعزل عظيمات من الفقاعة الماوس السمعية. أولا، يتم تشريح الفقاعة وكبسولة من كقطعة واحدة من الجمجمة (الشكل 1). ثم يتم استخدام الفقاعة تشريح لإعداد المطرقة (الشكل 2) وسندان والركابي (الشكل 3). معالم الفقاعة السمعية وكبسولة هي عملية إبري الشكل في نهاية الأمامي من الفقاعة، وقمة ظهري، قناة الهلالية الأمامية، والحفرة قرب المقوس (الشكل 1F). Microcomputed التصوير المقطعي (CT) والتصوير يكشف عظيمات في الفقاعة السمعية فضلا عن التوجهات الأمثل لباجتزاء الطولي والأفقي تلك العظيمات (الشكل 4). لباجتزاء البارافين الطولي للالمطرقة، وdecalcified الفقاعة وكبسولة في EDTA عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد، جزءا لا يتجزأ من السلطة الفلسطينيةكتلة RAFFIN في التوجه هو مبين في الشكل (4) A - C، مقطوع في 4 ميكرون، ثم ملطخة باستخدام H &amp; E. والمطرقة تعلق على الغشاء الطبلي في الفقاعة السمعية وكشفت التحجر غضروفي المستمر في P14 (الشكل 5A). لتصور تشكيل العظام الجديدة، calcein (30 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم) تم حقن peritoneally إلى الماوس P20، وعزلت الفقاعة وكبسولة بعد 24 ساعة عند P21. وكان جزءا لا يتجزأ من العينة دون زوال الكلس المجمدة ثم cryosectioned في 6 ميكرون باستخدام الفيلم لاصقة على أساس طريقة كاواموتو 43. بعد تلطيخ النووي مع دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole)، وقد لوحظ قسم تحت المجهر مضان. إشارات Calcein (الأخضر) كشفت تكوين عظام جديدة في المطرقة (م)، الفقاعة وكبسولة (الشكل 5B). لباجتزاء الأفقي للالمطرقة، وجزءا لا يتجزأ من الفقاعة السمعية معزولة عن ماوس البالغ من العمر 5 أسابيع المجمدة دون زوال الكلس (لالتوجه انظر الشكل 4D - F)، cryosectioned في 6 ميكرون باستخدام طريقة كاواموتو، وملطخة باستخدام H &amp; E. يظهر باجتزاء الأفقي للخنصر malleal الناتئ (ام. بي) أيضا القوقعة (الشكل 5C). وجهة نظر وسطي من عظيمات السمع الصحيحة معزولة عن ماوس P31 يظهر المظاهر التقليدية للالمطرقة الماوس، وهما &quot;مزلق-النورس يشبه الجناح&quot; (أو الفارسي 45 مثل السيف) المقبض، وهو الناتئ القصير بارز (نتوء الدويري انظر مناقشة)، والصفيحة مستعرضة (الشكل 6). لاحظ أن عملية الأمامي (الناتئ الأمامي) وقد اصيب بكسر في إجراء تشريح حول goniale وفصلت من الحلقة طبلي (ectotympanic). يسلك هذه عينة تمثيلية المفصل السنداني المطرقي سليمة بين المطرقة والسندان، في حين خلع المفصل السنداني الركابي. الإدراج الوترية في malleal والعمليات العضلات ركابي هي اكتشاف (الشكل 6A، العلامات النجمية). الشكل 6B يقارن الماوس وعظيمات السمع الإنسان في نفس التكبير. الاختلافات بين الأنواع، وغيرها من حجم، وتشمل ما يلي. المقبض malleal هي الجناح تشبه في الفئران ولكن مثل النادي في البشر. الزاوية بين محور التشريحية (أو محور الدوران، والخط من خلال عملية الأمامية من المطرقة وعملية قصيرة من سندان) والمقبض هو أصغر بكثير في الفئران وهما مواز تقريبا، في مقابل ما يقرب من عمودي في البشر 6،46-48. في عظيمات الإنسان، دراسات vibrometric تكشف أن المشترك-incudo الكعبية هو المحمول بدلا من الثابت وظيفيا 49. والمطرقة الماوس المعارض واسعة، ورقيقة، ومسطحة مستعرضة الصفيحة يست واضحة في البشر 47. في الفئران، الأمامي الناتئ الصمامات العظام غشائي، وهي goniale وطبلة الأذنج عصابة، بينما في البشر يتم تقليل الأمامي الناتئ إلى الشوكة صغيرة من العظام 41. والركابي من الفئران والبشر يختلف أيضا: في الفئران والساق الأمامية منحني والساق الخلفية هو أكثر مباشرة في حين أنه في البشر، والساق الأمامي هو أكثر مباشرة من الساق الخلفية. ومن الجدير بالذكر أن رئيس المطرقة بالنسبة لحجم الجسم وتوسيع نطاق واسع في أنواع مثل الخلد الذهبي، مما يدل على التباين الكبير في العلاقات المغايرة النسبية من &quot;أصغر&quot; عظام 48. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> الشكل 1. تشريح السمعية بولا وكبسولة. (أ) جمجمة الفأر P31 ينقسم إلى اليمين واليسار نصفين. A، الأمامي. P، الخلفي. L، غادر. R، أليس كذلك. (ب) سطح الإنسي من النصف الأيمن من رئيس البشرة شطر. CX، القشرة الدماغية. البنك التجاري، المخيخ. إفطار، المخnstem. D، الظهرية. V، بطني. (ج) إزالة الدماغ مع ملقط. (D) عرض الإنسي من الكبسولة السمعية في الجمجمة الصحيحة. قمة الظهرية (السهام) تقع بين الحفرة المتوسطة الجمجمة (ألف قدم مكعب) والخلفي الحفرة القحفية (الحزب الشيوعي الفرنسي) وتفصل ظهراني الأمامية والأسطح ventro الخلفي من الكبسولة السمعية. شريط الحجم، 2 مم. (E) التكبير العالي للالفقاعة السمعية وكبسولة (عرض وسطي). شارك، القوقعة. سابعا، العصب الوجهي. ثامنا، الدهليزي القوقعي العصبية. AC، الأمامي (متفوق) القناة الهلالية. SF، الحفرة تحت المقوسية، الذي يضم النديفة المخيخ. شريط الحجم، 1 مم. (F) صورة مجهرية من الفقاعة السمعية معزولة وكبسولة (عرض وسطي). يرة سورية، وعملية إبري الشكل. شريط الحجم، 1 مم. (A - E)، P31 الماوس. (F)، P33 الماوس. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> الشكل 2. تشريح المطرقة. (أ) عرض بطناني من الفقاعة السمعية المناسبة وكبسولة. والطبلي تلم (ST، السهم متقطع) هو موقع الحجز على الغشاء الطبلي. الوحشي العظام إلى ST هو جزء من الأذن الخارجية، والإنسي العظام إلى ST يشكل أرضية تجويف الأذن الوسطى. A، الأمامي. P، الخلفي. D، الظهرية. V، بطني. (ب) عرض بعد إزالة القناة السمعية الخارجية للكشف عن غشاء الطبل (TM) بما فيها الجزء الرخو (الجبهة الوطنية) والجزء الموتر (حزب العمال). (ج) إزالة أجزاء من العظم الطبلي (الخطوط المنقطة و#) بالقرب من malleal الناتئ القصير (ام. بي). م، المطرقة، ملي، المقبض malleal. السهم، فقاعة الهواء في تجويف الأذن الوسطى ينظر من خلال الغشاء الطبلي. (D) المطرقة مكشوف. وأشار رئيس المطرقة. منقطخط يشير إلى السطح المفصلي للسندان. (E) وتر العضلة الموترة للطبلة (تي تي) تعلق على المطرقة. يتم سحبها (F) وموترة الطبلة عندما يتم رفع المطرقة. * عملية العضلات. يتم قطع (G) الموترة للطبلة باستخدام إبرة. (H) ثلاثة عظيمات السمع بعد إزالة الغشاء الطبلي. هو خلع مفصل-incudo الكعبية. م، المطرقة، أنا، سندان، الصورة، الركابي، الذهاب، goniale (تنصهر في المطرقة وطبلي حلقة، TR). جميع الحانات الحجم، 0.5 مم. (A، H)، P33 الماوس. (B - G)، P31 الماوس. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> الشكل 3. تشريح سندان وعظمة الركاب. (A) سندان والركابي بعد إزالة المطرقة. الشريان الركابي (SA) يمر عبر الركابي (ق). خط منقط يشير إلى السطح المفصلي للسندان. لاحظ أن الساق قصيرة (ICB، الساق القصيرة) لسندان (ط) هو ثابت من الرباط الخلفي (لا يظهر). النجمة، عملية العضلات من الركابي. (ب) الركابي بعد إزالة سندان. يستخدم طرف إبرة لقطع الشريان الركابي (SA). السهم، واتجاه تدفق الدم. خط منقط يشير سطح مفصلي للالركابي. إزالة (C) الشريان الركابي من الركابي. X يشير إلى نهاية قطع الشريان الركابي (SA). (D) نافذة بيضاوية (آه، النافذة البيضوية أو الدهليز fenestra) مرئيا بعد إزالة الركابي. RW، نافذة مستديرة (مستديرة fenestra أو قوقعة fenestra). أشرطة النطاق، 0.5 مم. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا</a>الشكل. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> الشكل 4. توجيه السمعية بولا وكبسولة خلال تضمينها لالطولي (مجاور للسهمي، A - C) وأفقي (D - E) باجتزاء من المطرقة. (A - C) والرقبة ومستعرضة الصفيحة من المطرقة وضعت بالتوازي مع الجزء السفلي من تضمين الطبق. (أ) الجانب الشخصي: الصغرى CT الصورة لتظهر التضمين من المطرقة الحق في الفقاعة (pseudocolored الأزرق). وpseudocolored والمطرقة والسندان الأخضر. خط متقطع، المطلوب الطائرة القطع. خط الصلبة، أسفل تضمين الطبق. م، المطرقة، النصال، الظهرية قمة. M، سطي. L، الأفقي، D، الظهرية. V، بطني. (ب) أعلى عرض: مايكرو-CT الصورة. لاحظ أن نهاية الأمامي من (عملية إبري الشكل) الفقاعة تمت إزالة. ط، سندان. (C) أعلى عرض: صورة مجهرية (التي اتخذت معمرشح اللون). AC، الأمامي (متفوق) القناة الهلالية. سادس، الحفرة تحت المقوسية. يرة سورية، وعملية إبري الشكل. A، الأمامي. P، الخلفي. D، الظهرية. V، بطني. (D - F) وخنصر اليد الناتئ من المطرقة يتم وضع عمودي على الجزء السفلي من تضمين الطبق. (D) منظر جانبي: مايكرو-CT الصورة لتظهر التضمين من المطرقة الصحيحة. خط متقطع، المطلوب الطائرة القطع. خط الصلبة، أسفل تضمين الطبق. (E) أعلى عرض: مايكرو-CT الصورة. ملي، المقبض malleal. (F) أعلى عرض: صورة مجهرية (التي اتخذت مع مرشح اللون). الحانات الحجم، 1 مم. تم الحصول عليها صور مايكرو-CT في قرار فوكسل من 5 ميكرون، كما هو موضح سابقا 7. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> Figure 5. علم الأنسجة. (أ) H &amp; E تلطيخ. المقطع الطولي (مجاور للسهمي) من المطرقة جزءا لا يتجزأ من البارافين الصحيحة (م) في الفقاعة السمعية (الخط المنقط) في P14. TM، الغشاء الطبلي. (ب) Calcein العظام وصفها. المقطع الطولي للالمجمدة، المطرقة اليسرى undecalcified (م) في الفقاعة السمعية في P21. مباين، دابي. (C) H &amp; E تلطيخ. القسم الأفقي للخنصر اليد المجمدة، undecalcified ترك malleal الناتئ (ام. بي) في الفقاعة السمعية وكبسولة (الماوس البالغ من العمر 5 أسابيع). شارك، القوقعة. الحانات الحجم، 1 مم. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> الشكل 6. الإنسي منظر السمعية العظيمات. (A) عظيمات السمع رايت P31 الماوس. A، الأمامي. P، الخلفي. D، الظهرية. V، بطني. شريط الحجم، 1 مم. المطرقة الرأس (كابوت للمطرقة، رؤيس المطرقة)؛ العنق (عنق المطرقة)؛ الصفيحة (الصفيحة مستعرضة)؛ ملي (المقبض المطرقة)؛ النجمة السوداء (عملية العضلات من المطرقة)؛ MPA (الناتئ الأمامي، الناتئ الناحلة)؛ MPB (الناتئ القصير)؛ هيئة سندان (كوربوس سندان)؛ ICB (الساق القصيرة، الساق قصيرة، عملية قصيرة)؛ ICL (الساق الطويلة، الساق الطويل، عملية طويلة)؛ IPL (الناتئ العدسي، عملية عدسي، سيلفيان نتوء)؛ رئيس الركابي (رأس الركاب)؛ النجمة البيضاء (عملية العضلات من الركابي)؛ هيئة السلع التموينية (الساق الأمامية، الساق الأمامية)؛ اللجنة الدائمة (الساق الخلفي، الخلفي الساق)؛ قاعدة (للركاب الأساس، الصفيحة القدمية)؛ قوات العمليات الخاصة (الثقبة المسد، الثقبة بين السويقات). (ب) عظيمات السمع حق أنثى الإنسان البالغ من العمر 76 عاما (بالإذن من قسم التشريح، كيو كلية الطب بجامعة). وعظيمات من الماوس P31 (أسفل اليمين) يتم تصوير في نفس التكبير الذي استعمل لعظيمات الإنسان. المنحنياتوتشير السهام إد الزاوية بين محور التشريحية والمقبض (الخطوط المنقطة). شريط الحجم، 2 مم. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis at JoVE.com

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

تشريح السمعية بولا بعد الولادة في الفئران: عزل العظام الأذن الوسطى وتحليل النسيجي

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

dissection-auditory-bulla-postnatal-mice-isolation-middle-ear-bones

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.9K Views.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Video: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

الجسيمة والجميلة تشريح الأذن الداخلية الظهارة الحسية في اسماك الزرد الكبار ( دانيو rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

عزل الأطفال حديثي الولادة خارج الكبد Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white preadipocyte cell lines. These cultured cell lines, however, have limitations. They do not fully capture the diverse functional spectrum of the heterogenous adipocyte populations that are now known to exist within white adipose depots. To provide a more physiologically relevant model to study the complexity of white adipose tissue, a protocol has been developed and optimized to enable simultaneous isolation of primary white and brown adipocyte progenitors from newborn mice, their rapid expansion in culture, and their differentiation in vitro into mature, fully functional adipocytes. The primary advantage of isolating primary cells from newborn, rather than adult mice, is that the adipose depots are actively developing and are, therefore, a rich source of proliferating preadipocytes. Primary preadipocytes isolated using this protocol differentiate rapidly upon reaching confluence and become fully mature in 4-5 days, a temporal window that accurately reflects the appearance of developed fat pads in newborn mice. Primary cultures prepared using this strategy can be expanded and studied with high reproducibility, making them suitable for genetic and phenotypic screens and enabling the study of the cell-autonomous adipocyte phenotypes of genetic mouse models. This protocol offers a simple, rapid, and inexpensive approach to study the complexity of adipose tissue in vitro.

This report describes a protocol for the simultaneous isolation of primary brown and white preadipocytes from newborn mice. Isolated cells can be grown in culture and induced to differentiate into fully mature white and brown adipocytes. The method enables genetic, molecular, and functional characterization of primary fat cells in culture.

عزل وتمايز الخلايا التمهيدية الأولية البيضاء والبنية من الفئران حديثي الولادة

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>تشريح الكيس اللمفاوي من الفئران

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

تشريح الكيس اللمفاوي من الفئران

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...