Name: rna purification from intracellularly grown listeria monocytogenes in macrophage cells
Uploaded: 2016-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells at JoVE.com

The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.

ملاحظة: خلال التجربة بأكملها، يتم تحضين خلايا البلاعم عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة الهواء القسري واتخاذها للخروج من الحاضنة فقط عن التلاعب التجريبية، التي تتم في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية. العمل مع L. بكتيريا الليستريا هي وفقا لمستوى السلامة البيولوجية 2 اللوائح. 1. خلية التحضير والعدوى البكتيرية (يوم 1 و 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور نخاع 2.0 × 10 7 العظام الخلايا المشتقة من البلاعم (BMDM) على طبق 145 ملم في 30 مل BMDM + القلم بكتيريا وسائل الإعلام (الجدول 2). البذور 3 لوحات لكل سلالة بكتيرية ليتم تحليلها. احتضان ليلا 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة القسري في الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها من النوع البري (WT) L. المستوحدة 10403S السلالة في 10 مل من القلب الدماغ ضخ (BHI) المتوسطة، عند 30 درجة مئوية في حاضنة القياسية. أنابيب مكان ثقافة مائلة دون أن تهتز. ملاحظة:هذه الشروط نمو يصل تنظيم التعبير عن الجينات سياط، وهو ما يعزز العدوى كفاءة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المتوسطة قبل الدافئة BMDM (بدون المضادات الحيوية القلم بكتيريا) (الجدول 2) والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أحادي الطبقة بلعم مرتين مع 25 مل من قبل تحسنت برنامج تلفزيوني لإزالة المضادات الحيوية. إضافة 30 مل الطازجة BMDM المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 1.5 مل من ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها مع برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي البكتيريا في&gt; 14000 x ج لمدة 1 دقيقة، ونبذ طاف، وإعادة التعليق البكتيريا بلطف في 1.5 مل من برنامج تلفزيوني قبل pipetting. كرر مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب كل لوحة بلعم مع 0.5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها غسلها من النوع البري L. الليستريا. في حالة استخدام لوحات متعددة، ويصيب كل لوحة 15 دقيقة بعيدا. وهذا الفاصل الزمني تمكين حصاد كل لوحة على حدة في نهاية العدوى. ملاحظة: يتم يعاير وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من خلال طلاء التخفيف المتسلسلالصورة من ثقافة البكتيرية المستخدمة للعدوى على لوحات BHI أجار والفرز مستعمرة (كفو) بعد 24 ساعة حضانة لوحات عند 37 درجة مئوية. باستخدام 0.5 مل من WT L. اللستيريا سلالة النتائج 10403S في وزارة الداخلية من ~ 100 (100 البكتيريا كفو لكل خلية بلعم). عند تحليل المسوخ البكتيرية معيبة في نمو الخلايا، ينبغي النظر في وزارة الداخلية أعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 0.5 حضانة ساعة على 37 درجة مئوية، وغسل الخلايا المصابة مرتين مع برنامج تلفزيوني، لإزالة البكتيريا غير مرتبط، وإضافة 30 مل قبل تحسنت BMDM المتوسطة. والبكتيريا تعلق استيعاب خلال ساعة 0.5 المقبلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 1 ساعة بعد الإصابة، إضافة 30 ميكرولتر من الجنتاميسين (1: 1000 لتصل إلى تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل) لقتل البكتيريا خارج الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع جهاز فلتر عن طريق وضع رأس المرشح على قارورة السائل جمع مع منفذ فراغ منفذ. ثم وضع فلتر (0.45 ميكرون) على رأس المرشح، تليها قمع اسطوانة وتأمين مناطق مختلفة مع معدن جمصباح. تحضير الماء ريبونوكلياز خالية من الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 6 ساعة بعد العدوى والبكتيريا الحصاد من الخلايا المصابة كما يلي. علاج كل لوحة على حدة. ملاحظة: عادة، L. اللستيريا يكمل 1-سجل النمو خلال 6 ساعات من العدوى في خلايا البلاعم. حضانات أطول يمكن أن يؤدي إلى فرط نمو جرثومي وموت الخلايا في الضامة، في حين فترات حضانة أقصر يمكن أن يؤدي إلى الحمل البكتيري أقل من ذلك بكثير. وزارة الداخلية والوقت من العدوى يمكن تعديلها للوصول إلى أفضل الظروف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا المصابة مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إضافة 20 مل من الماء ريبونوكلياز خالية من الجليد البارد لليز خلايا البلاعم. استخدام مكشطة الخلية، كشط الخلايا قبالة اللوحة بسرعة ولكن بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا هي lysed إلى أنبوب مخروطي 50 مل. دوامة لمدة 30 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير طاف من خلال جهاز تصفية باستخدام نظام فراغ. باستخدام الملقط، ولفة من مرشح وبسرعة نقلها إلى 15 مل المخروطأنبوب كال. الأداة الإضافية تجميد أنابيب مع المرشحات في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع جهاز الترشيح مع فلتر جديد للعينة القادمة، كما هو موضح في 1.2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين مرشحات المجمدة في -80 درجة مئوية لليوم التالي. بدلا من ذلك، انتقل مباشرة إلى استخلاص الحمض النووي. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. الأحماض النووية استخراج (يوم 3) ملاحظة: تنفيذ كافة التلاعب مع حلول الفينول والكلوروفورم في غطاء الدخان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1: مزيج 1 من الفينول المحمضة: الكلوروفورم، 400 ميكرولتر لكل عينة. خلط في أنابيب منفصلة، ​​ثم سحب الطبقة المائية الناجم عن الطموح. إضافة 40 ميكرولتر من 10٪ SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الأنابيب التي تحتوي على فلتر على الجليد للحفاظ على البرودة. إلى كل أنبوب يحتوي على فلتر إضافة 650 ميكرولتر من EDTA-خلات (AE) العازلة (الجدول 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بالخطوات التالية في أقرب وقت ممكن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة بقوة الأنبوب الذي يحتوي على فلتر لذلكأن المرشح يخفق إلى المحيط الخارجي للأنبوب وعازلة يغسل تماما التصفية. احتفظ البرد أنبوب عن طريق وضعه مرة أخرى على الجليد. ملاحظة: قد يكون من الضروري بالإضافة إلى دوامة أنبوب بينما مقلوب لغسل بالكامل البكتيريا قبالة التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكرر للجميع الأنابيب. قد يكون من المفيد أن تدور إلى أسفل التعليق قريبا (1 دقيقة في 120 x ج) في نهاية العملية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المخزن المؤقت البكتيريا التي تحتوي على أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على SDS ومزيج الفينول / الكلوروفورم (كما أعد 2.1). أكرر للجميع الأنابيب. قد يكون من الضروري أن تدور التصفية التي تحتوي على أنابيب (1 دقيقة في 120 x ج) مرة أخرى للحصول عازلة المتبقي من التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع كل 1.5 مل الأنابيب في جهاز دوامة متعددة أنبوب، ودوامة بأقصى سرعة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنابيب في C كتلة الحرارة 65 درجة لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة (&gt; 14000 x ج) لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبقة المائية (حوالي 400 ميكرولتر) من كل رأوبي إلى أنبوب 1.5 مل جديدة تحتوي على 40 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) والايثانول 1.0 مل من 100٪. دوامة كل أنبوب دقيق. ملاحظة: الجليكوجين يمكن أن تضاف إلى هذه الخطوة لتحسين التصور من بيليه عجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه العينات في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بدلا من ذلك، احتضان العينات عند -20 درجة مئوية خلال الليل. ثم، الطرد المركزي العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على السرعة القصوى (&gt; 14000 x ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية قبالة الإيثانول (الطبقة العليا) من كل أنبوب. إضافة 500 ميكرولتر الباردة الايثانول 70٪ لكل عينة ودوامة تماما. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على السرعة القصوى (&gt; 1 4000 x ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية قبالة الإيثانول من كل أنبوب. تجفيف العينات لحوالي 2 دقيقة باستخدام المبخر فراغ دون تدفئة. لا تبالغ في تجفيف العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز لكل عينة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعناية وتدور الدوامة إلى أسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الحمض النووي الريبي في تيانه عينات باستخدام microvolume أشعة فوق البنفسجية فيس معمل. نتوقع أن استخراج حوالي 0،5-1 ميكروغرام من الأحماض النووية لكل لوحة. ملاحظة: مكررات التقنية يمكن الجمع في هذه المرحلة. </li></ol> 3. الدناز العلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد رد فعل وفقا للجدول 1 في أنبوب microfuge. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. إضافة 450 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز و 500 ميكرولتر من الفينول كلوروفورم-IAA مزيج (الجدول 2)، مراحل منفصلة بواسطة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة على السرعة القصوى (&gt; 14000 x ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبقة المائية لأنبوب جديد وإضافة 500 ميكرولتر الكلوروفورم-IAA مزيج (الجدول 2)، ودوامة مراحل منفصلة من 2 دقيقة الطرد المركزي في السرعة القصوى (&gt; 14000 x ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبقة المائية لأنبوب جديد وإضافة 1 مل من الايثانول و 50 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2). دوامة. ملاحظة: الجليكوجين يمكن أن تضاف إلى هذه الخطوة لتحسين التصور من بيليه عجل. </li><lط&gt; احتضان لمدة 1 ساعة على -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، احتضان العينات عند -20 درجة مئوية خلال الليل. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على السرعة القصوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية قبالة الإيثانول من كل أنبوب. إضافة 500 ميكرولتر الباردة الايثانول 70٪ لكل عينة ودوامة تماما. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على السرعة القصوى. نضح بعناية قبالة الإيثانول من كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف العينات لحوالي 2 دقيقة باستخدام المبخر فراغ دون تدفئة. لا تبالغ في تجفيف العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه، واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، دوامة، وتدور باستمرار. العينات تحتوي على الحمض النووي الريبي النقى الاحتفاظ بها على الجليد. بدلا من ذلك، حل الحمض النووي الريبي في ريبونوكلياز خالية H 2 O مع 0.1 ملي EDTA أو TE العازلة (10 ملي تريس، 1 ملم EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام microvolume أشعة فوق البنفسجية فيس معمل. نتوقع ~ 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لكل عينة (إذا كان يتم الجمع بين مكررات التقنية). ملاحظة: استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لهذا البروتوكول هو مناسبة FOص تحليل النسخ الجيني بواسطة تقنيات متعددة. ونحن عادة استخدام تحليل RT-QPCR لدراسة L. المستوحدة النسخ الجيني خلال العدوى من خلايا البلاعم 1-4. </li></ol>

<ol>
	<li>Lobel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+regulator+CodY+links+Listeria+monocytogenes+metabolism+to+virulence+by+directly+activating+the+virulence+regulatory+gene+prfA.">The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA.</a> Mol Microbiol. , (2014).</li><li>Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomic+analysis+identifies+isoleucine+and+CodY+as+regulators+of+Listeria+monocytogenes+virulence.">Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence.</a> PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).</li><li>Kaplan Zeevi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+multidrug+resistance+transporters+and+cyclic+di-AMP,+which+contribute+to+type+I+interferon+induction,+play+a+role+in+cell+wall+stress.">Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress.</a> J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).</li><li>Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophage+excision+activates+Listeria+competence+genes+that+promote+phagosomal+escape+and+virulence.">Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence.</a> Cell. 150, 792-802 (2012).</li><li>Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+human+listeriosis.">The epidemiology of human listeriosis.</a> Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).</li><li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+a+multifaceted+model.">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li><li>Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+listeria+monocytogenes+virulence.">Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence.</a> Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).</li><li>Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Listeria+monocytogenes+infection:+the+intersection+of+bacterial+pathogenesis+and+cell-mediated+immunity.">The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity.</a> J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).</li><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen.">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).</li><li>Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Mycobacterium+tuberculosis+RNAs+synthesized+in+response+to+phagocytosis+by+human+macrophages+by+selective+capture+of+transcribed+sequences+(SCOTS).">Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).</li><li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Listeria+transcriptional+landscape+from+saprophytism+to+virulence.">The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li><li>Schnappinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages:+Insights+into+the+Phagosomal+Environment.">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J Exp Med. 198, 693-704 (2003).</li><li>Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing-based+discovery+of+the+Chlamydia+trachomatis+transcriptome.">Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).</li><li>La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+whole+bacterial+pathogen+transcription+within+infected+hosts.">Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).</li><li>Rienksma, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+insights+into+transcriptional+adaptation+of+intracellular+mycobacteria+by+microbe-enriched+dual+RNA+sequencing.">Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing.</a> BMC Genomics. 16, 34 (2015).</li><li>Afonso-Grunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+3'Seq+using+deepSuperSAGE+uncovers+transcriptomes+of+interacting+Salmonella+enterica+Typhimurium+and+human+host+cells.">Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells.</a> BMC Genomics. 16, 323 (2015).</li><li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells.">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).</li><li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD,+10403S,+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity.">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5, e00969-e900914 (2014).</li><li>Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+gamma-interferon+receptor+that+regulates+macrophage+tumoricidal+activity.">Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity.</a> J Exp Med. 160, 55-74 (1984).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

بروتوكول صفها هنا يمثل طريقة الأمثل لعزل الحمض النووي الريبي البكتيرية من L. المستوحدة نمو البكتيريا داخل الخلية في خلايا البلاعم. ويستند هذا البروتوكول على تحلل الخلية التفاضلية وتضم اثنين من الخطوات الرئيسية لتخصيب اليورانيوم من الحمض النووي الريبي البكتيرية: بلعم الترسيب نوى باستخدام الطرد المركزي ومجموعة السريع للبكتيريا عن طريق الترشيح. يتم اتباع هذه الخطوات عن طريق إجراء استخراج الحمض النووي الريبي القياسية. بينما يصف هذا البروتوكول تنقية من الحمض النووي الريبي ليستري، ويمكن تعديلها بسهولة لمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. على الرغم من أن أسلوب يركز على تنقية من الحمض النووي الريبي لتحليل النسخي، ومبدأ تستخدم لفصل نمو البكتيريا داخل الخلية من مضيفه يمكن أن تطبق أيضا لتنقية مكونات بكتيرية أخرى، مثل الحمض النووي والبروتينات والجدار الخلوي، الخ هذه الجينومية و أن التحليلات الكيميائية الحيوية توفير فهم أفضل وتوصيف العوامل المسببة للأمراض الخلايادورة الحياة أثناء العدوى. تؤدي هذه الممارسة إلى ~ 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع البكتيرية. على الرغم من أن عائدات RNA منخفضة نسبيا، فهي مناسبة لتحليل المصب من النسخ الجيني باستخدام تقنيات متعددة، مثل RT-QPCR، RNA تسلسل والتكنولوجيات الحديثة التهجين مقرها. لتحسين المحاصيل RNA، فمن المستحسن استخدام اللقاح جديدة البكتيرية، وكذلك حل الفينول nuclease خالية من المياه العذبة ومخازن لتجنب التلوث ريبونوكلياز الممكنة. البكتيريا حصادها والحمض النووي الريبي معزولة يجب أن أبقى دائما على الجليد أثناء عملية الاستخراج. الساعة العدوى يمكن تعديلها حسب هذه المسألة البيولوجية ودراستها للكائن الحي. لزيادة كميات من الحمض النووي الريبي، وتجربة يمكن زيادتها لتشمل المزيد من لوحات العدوى في كل عينة. مصدر القلق الرئيسي عند تنفيذ هذه التجربة هي مخاطر تغيير الوضع نسخ من البكتيريا خلال الخطوات الحصاد. معظم bacterالجيش العراقي الرد على درجات الحرارة الباردة من خلال تفعيل استجابات التوتر صدمة الباردة، ويجب أن يتم تنفيذ الحصاد وبالتالي البكتيرية في أسرع وقت ممكن. وينبغي إعداد الكواشف والمعدات في وقت مبكر، وينبغي أن يعامل كل عينة على حدة. الخطوة الأكثر أهمية هو تجميد فورا البكتيريا التي تحتوي على فلتر في النيتروجين السائل. الفشل في القيام بذلك قد يقلل بشكل كبير نوعية الحمض النووي الريبي معزولة. خطوة حاسمة أخرى في هذا البروتوكول هو هطول الأمطار الإيثانول من كميات صغيرة نسبيا من الأحماض النووية. وينبغي إيلاء عناية اضافية عدم تعطيل غير مرئية الأحماض النووية بيليه. ويمكن أن يضاف الجليكوجين إلى حل هطول الأمطار لتحسين التصور من بيليه خلال هذه الخطوات. بالنسبة لبعض التطبيقات اللاحقة، على سبيل المثال، RT-QPCR، وإزالة الحمض النووي أمر بالغ الأهمية. على الرغم من أننا لا نرصد بشكل روتيني كفاءة العلاج الدناز، والحد من 3-5 أضعاف في المبلغ الإجمالي من الأحماض النووية التالية الدناز رreatment إرشادية للعلاج الدناز فعالة. وتجدر الإشارة، أي تقنية متاحة تجاريا أو عدة لإزالة الحمض النووي من عينات الحمض النووي الريبي مناسبة. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام عينات مراقبة الجودة، مثل عينة مع عدم وجود النسخ العكسي يؤديها، هو مفيد في مثل هذه التطبيقات. العيوب الرئيسية للبروتوكول وصفها هنا هو كمية قليلة نسبيا من الحمض النووي الريبي المستخرج، وهي عبارة عن 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع. وهكذا، هذه التقنية ليست مناسبة لتقنيات التهجين الكلاسيكية، مثل تحليل لطخة الشمالي، والتي تتطلب ميكروغرام من الحمض النووي الريبي. التقدم التكنولوجي الحديث في تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA عميق وما يليها) يمكن تحليل كل من العوامل المسببة للأمراض البكتيرية والثدييات ملامح النسخ المضيف معا، دون الحاجة إلى فصل الرنا، وأسلوب يسمى &#39;الحمض النووي الريبي وما يليها المزدوج &quot;16-18. على الرغم من أن تحليل الحمض النووي الريبي وما يليها ثنائي مثالي في دراسة التفاعل المضيف الممرض، فمن مكلفه جداه والتي لا يمكن استخدامها في كثير من الأحيان. لأن محتوى الحمض النووي الريبي البكتيرية في الخلايا المصابة منخفضة بشكل خاص، فإنه من الصعب للغاية ومكلفة للحصول على ما يكفي من بكتيريا يقرأ لتحليل الفعال التعبير الجيني، حتى مع عمق قراءة عالية توفرها منصات التسلسل الجديدة. لكن هناك عائقا إضافيا لهذا النهج هو الاستخدام المتكرر للخطوة RNA أو كدنا] التضخيم، مما قد يؤدي إلى نتائج متحيزة في التعبير الجيني. الطريقة المعروضة هنا يقدم حلا وسطا بين المعلومات التي تم الحصول عليها والفعالية من حيث التكلفة.

مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا ─ البكتيريا المسببة للأمراض المعدية وقادرة على النمو والتكاثر داخل الخلايا الجنود البشري ─ لا مشكلة صحية رئيسية في جميع أنحاء العالم 5. غزو ​​وتكرار داخل الخلية الثديية، وقد اكتسبت مسببات الأمراض داخل الخلايا آليات الفوعة متطورة والعوامل. في حين أن هذه الآليات الأساسية إلى القدرة على التسبب في المرض، ونحن لا نعرف إلا القليل عن تنظيم وديناميتها. منذ ملامح التعبير الجيني من البكتيريا نما في وسائل الإعلام السائل لا تعكس البيئة الفعلية داخل الخلايا المضيفة، هناك حاجة متزايدة لTranscriptome على تحليل البكتيريا نما في منافذها داخل الخلايا. وهذه التحليلات تمكين فك رموز من التعديلات البكتيرية المحددة الناجمة عن المضيف، وسوف تساعد على تحديد أهداف جديدة للتصميم العلاجية. تحليل Transcriptome على من البكتيريا نما داخل الخلية التي تشكل تحديا كبيرا منذ RNA الثدييات يفوق عدد الجيش الملكي النيبالي البكتيرية التي كتبها فيلا يقل عن عشرة أضعاف. في هذا المخطوط، وصفنا طريقة تجريبية لعزل الحمض النووي الريبي البكتيرية من الليستيريا المستوحدة نمو البكتيريا داخل خلايا البلاعم الفئران. الحمض النووي الريبي المستخرج يمكن استخدامها لدراسة التعديلات داخل الخلايا وآليات الفوعة من البكتيريا المسببة للأمراض من خلال تقنيات مختلفة من التحليل النسخ، مثل RT-PCR، RNA تسلسل، ميكروأري وغيرها من التكنولوجيات التهجين مقرها. اللستيريا L. هي العامل المسبب لداء الليستريات في البشر، وهو مرض مع المظاهر السريرية تستهدف في المقام الأول الأفراد المناعة والمسنين والنساء الحوامل 6. هذا هو الممرض داخل الخلايا الاختياري موجبة الجرام أن يغزو مجموعة واسعة من خلايا الثدييات التي استخدمت لعقود نموذجا في التفاعلات المضيف الممرض يدرس 7. على الغزو، ويقيم في البداية في فجوة أو يبلوع (في حالة الخلايا البلعمية)، والتي يجب أن الهروب إلى رانه استضافة العصارة الخلوية الخلية من أجل تكرار. وقد تبين أن عدة عوامل الفوعة للتوسط في عملية الهروب، وعلى رأسها ما يسمى بحالة دموية تشكيل المسام، Listeriolysin O (LLO) واثنين من فوسفوليباز إضافية 8. في العصارة الخلوية للبكتيريا تستخدم المضيف الآلات الأكتين البلمرة لدفع أنفسهم على خيوط الأكتين داخل الخلية وتنتقل من خلية إلى أخرى (الشكل 1). كلها عوامل الفوعة الرئيسية للL. اللستيريا المشاركة في الغزو، والبقاء داخل الخلايا وتكرارها، وتفعيلها من خلال النسخ المنظم الفوعة الماجستير، PrfA. 8-10. في العقد الماضي، العديد من الدراسات التي أجريت من قبل الولايات المتحدة وآخرون أساليب تحليل Transcriptome على من البكتيريا نما داخل الخلية تطبيقها بنجاح داخل الخلايا المضيفة 2،11-15. وتستخدم نهجين رئيسيين لفصل الحمض النووي الريبي البكتيرية من المضيف الحمض النووي الريبي والتي تقوم على: 1) إثراء الانتقائي من الحمض النووي الريبي البكتيرية و2) عزل الحمض النووي الريبي عن طريق زراعية مختلفةتحلل الخلية rential. يعتمد الأسلوب الأول على التهجين مطروح من إجمالي مقتطفات الحمض النووي الريبي لجزيئات الحمض النووي الريبي الثدييات (على سبيل المثال باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا) أو التقاط الانتقائي للتسلسل كتب البكتيرية (الاسكتلنديين) 11. ويعتمد النهج الثاني على تحلل التفاضلية من البكتيريا والخلايا المضيفة، التي يتم فيها هي lysed الخلايا المضيفة بينما تبقى الخلايا البكتيرية سليمة. ثم يتم فصل الخلايا البكتيرية من المحللة الخلية المضيفة، عادة عن طريق الطرد المركزي، ويتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام التقنيات القياسية. المشكلة الرئيسية باستخدام هذا النهج هو الذي جنبا إلى جنب مع البكتيريا سليمة، يتم عزل الخلايا المضيفة أيضا نوى، وبالتالي فإن الاستعدادات الحمض النووي الريبي لا تزال تحتوي على الحمض النووي الريبي الثدييات. طريقة واحدة للتغلب على هذه المشكلة هي فصل البكتيريا سليمة من نوى الخلايا المضيفة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، رغم أن هذا الإجراء عادة ما يستغرق وقت رفع قلق من التغيرات في الجينات الشخصية التعبير أثناء الاستخراج. في هذه الورقة نقدم لبا تحسين والسريعبروتوكول استخراج cteria RNA، الذي يقوم على نهج تحلل الخلية التفاضلية. أولا، L. وهي lysed اللستيريا إصابة خلايا البلاعم مع الماء البارد. وبعد ذلك، تتم إزالة النوى بلعم بواسطة الطرد المركزي وجيزة والبكتيريا سليمة يتم جمع بسرعة على مرشحات، والتي من الحمض النووي الريبي المعزولة من خلال استخراج الفينول SDS الساخن من الأحماض النووية البكتيرية.

<table><tbody><tr><td>Listeria monocytogenes 10403S</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice</td><td></td><td></td><td>&lt;sup&gt;21&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, RNAse free</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td>DEPC-treated water can be used</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline-PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Brain heart infusion (BHI)</td><td>Merckmillipore</td><td>1104930500</td><td></td></tr><tr><td>Phenol saturated pH 4.3</td><td>Fisher</td><td>BP1751I-400</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Iso-amyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>SDS 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>Merck Millipore</td><td>1070174000</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; forced-air incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model 3111</td><td></td></tr><tr><td>Cell scrapers</td><td>Nunc</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Kontes glass holder for 45 mm filters</td><td>Fisher</td><td>K953755-0045</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore filters 45&amp;nbsp;mm, 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac system</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>Model G560E</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>145 mm cell culture dishes</td><td>Greiner</td><td>639 160</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml tubes, RNase-free</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;deg;C incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>65 &amp;deg;C heat block</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C table centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Sterile pipettes, 25 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 50 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna purification from intracellularly grown listeria monocytogenes in macrophage cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

ويرد في النظام النموذجي في الشكل (1) ويشمل خلايا البلاعم المصابين L. المستوحدة البكتيريا، التي تكرار في العصارة الخلوية بلعم الشكل 2 يمثل المخطط التجريبي الشكل 3 يمثل نتائج نموذجية من هذا التحليل RT-QPCR الجينات الفوعة خلال WT L. المستوحدة النمو في الضامة بالمقارنة مع النمو في غني المتوسطة مختبر BHI. وأظهرت النتائج أن مستويات نسخ من اثنين من عوامل الفوعة الرئيسية للL. الليستريا. ترميز HLY LLO السموم واكتا ترميز الأكتين البروتين التجمع، والتي يسببها بقوة على إصابة الضامة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54044/54044fig1.jpg" /> الشكل 1: لمحة عامة عن L. المستوحدة لايف ستايل على شكل Intracellular مسببات الأمراض. L. اللستيريا يغزو الخلايا المضيفة معربا عن بروتينات متخصصة تسمى internalins التي تحفز على استيعاب نشط في الخلايا غير البلعمية، في حين أن الخلايا البلعمية يبلعم البكتيريا. على الغزو، L. وجدت اللستيريا في البداية داخل فجوة الاندوسوم / يبلوع من الذي يهرب بسرعة معتمدين بالدرجة الأولى على السم listeriolysin O (LLO). داخل الخلية المضيفة العصارة الخلوية L. اللستيريا يعيد بسرعة، وينتشر من خلية إلى أخرى باستخدام الحركة القائمة على الأكتين عن طريق بروتين ناقل لها. وينظم كل عوامل الفوعة ذكره المنشط الفوعة الماجستير، PrfA. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54044/54044fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54044/54044fig2.jpg" /> الشكل 2: مخطط تدفق تمثيل إكسبالإجراءات erimental. وتشمل الخطوات الرئيسية تحلل الخلايا المصابة، والفصل بين أنوية الخلايا المضيفة وخلايا البكتيريا وعزل الحمض النووي الريبي. الخطوات الحاسمة موضحة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54044/54044fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54044/54044fig3.jpg" /> الشكل 3: تحليل النسخ من الجينات الفوعة خلال L. اللستيريا بين الخلايا النمو. تحليل النسخ من الجينات HLY (ترميز LLO) والجينات ACTA خلال L. اللستيريا 10403S نمو الخلايا في خلايا البلاعم في 6 ساعات بعد الإصابة بالمقارنة مع مستوياتها خلال النمو المتسارع في BHI المتوسطة باستخدام تحليل RT-QPCR. وتتمثل مستويات النسخ والكمية النسبية (RQ)، نسبةإلى المستويات النسخ خلال النمو في BHI. وكانت مستويات النسخ تطبيع إلى مستويات 16S الريباسي باسم الجينات المرجعية. البيانات هي ممثل من 3 يكرر البيولوجية المستقلة (N = 3). أشرطة الخطأ تمثل فاصل الثقة 95٪. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54044/54044fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> RNA </td><td> لتصل إلى 2 ميكروغرام (في حجم أقصى 44 ميكرولتر) </td></tr><tr><td> عازلة 10X الدناز </td><td> 5 ميكرولتر </td></tr><tr><td> المياه خالية من ريبونوكلياز </td><td> كاملة إلى 50 ميكرولتر اجمالى حجم </td></tr><tr><td> الدناز </td><td> 1 ميكرولتر (1 وحدة) </td></tr></tbody></table> الجدول 1: الدناز بروتوكول رد الفعل. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1. 500 مل BMDوسائل الإعلام M + القلم بكتيريا (تصفية تعقيمها): </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 235 مل </td></tr><tr><td> FBS (المعطل مدة 30 دقيقة في 54 ° C) </td><td> 100 مل </td></tr><tr><td> M-CSF (L-929 مكيفة متوسطة) 19 </td><td> 150 مل </td></tr><tr><td> الجلوتامين </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> البيروفات الصوديوم </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> بيتا المركابتويثانول </td><td> 0.5 مل </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> مجموع </td><td> 500 مل </td></tr><tr><td> 2. 500 مل BMDM (تصفية تعقيمها): </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 235 مل </td></tr><tr><td> FBS (المعطل مدة 30 دقيقة في 54 ° C) </td><td> 100 مل </td></tr><tr><td> M-CSF (L-929 مكيفة متوسطة) 19 </td><td> 150 مل </<html> td&gt; </tr><tr><td> الجلوتامين </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> البيروفات الصوديوم </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> بيتا المركابتويثانول </td><td> 0.5 مل </td></tr><tr><td> مجموع </td><td> 500 مل </td></tr><tr><td> 3. عازلة AE </td><td></td></tr><tr><td> NaOAc درجة الحموضة 5.2 </td><td> 50 ملي </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 10 ملي </td></tr><tr><td> المياه خالية من ريبونوكلياز </td><td></td></tr><tr><td> 4. الفينول كلوروفورم-IAA </td><td></td></tr><tr><td> الفينول </td><td> 25 مل </td></tr><tr><td> الكلوروفورم </td><td> 24 مل </td></tr><tr><td> ايزو الأميل الكحول </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> 5. الكلوروفورم-IAA </td><td></td></tr><tr><td> الكلوروفورم </td><td> 24 مل </td></tr><tr><td> ايزو الأميل الكحول </td><td> 1 مل </td></tr></tbody></table>= &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; الجدول 2: وصفات من وسائل الإعلام والمخازن.

Watch this Scientific Journal Video about RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells at JoVE.com

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في خلايا البلاعم

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

rna-purification-from-intracellularly-grown-listeria-monocytogenes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

9.1K Views.  Tel Aviv University. Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

Video: RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

تنقية من الفجوات المرضي من<em&gt; البكتيريا</em&gt; المصابة البالعات

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

النقل الشفوي لل<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في الفئران عن طريق ابتلاع الطعام الملوث

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

استخدام مسببات الأمراض بكتيرية للتحقيق لاستجابات المضيف الخلوية ومستوى أورجانيسميك

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...

Flow Cytometry Analysis of Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes In Vitro

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we quantify intracellular and extracellular Listeria monocytogenes, an intracellular pathogenic bacteria, following their infection of cultured macrophages in vitro using flow cytometry.

تحليل قياس التدفق الخلوي لجينات الليستريا المستوحدة داخل الخلايا والناشئة خارج الخلية في المختبر

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا

تنقية من الفجوات المرضي من

النقل الشفوي لل

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض

باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

استخدام مسببات الأمراض بكتيرية للتحقيق لاستجابات المضيف الخلوية ومستوى أورجانيسميك

خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف

تحليل قياس التدفق الخلوي لجينات الليستريا المستوحدة داخل الخلايا والناشئة خارج الخلية في المختبر