This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. اقحي تطور الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المواد النباتية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة Medicago truncatula النوع البري Jemalong أو إسوي القريب لها، وإعادة التركيب الوراثي للغاية generable Jemalong 2HA 13 (المعروف باسم 2HA) في البيوت الزجاجية مع الضوئية 14 ساعة و 23 ° C / 19 ° C درجة الحرارة اليوم / ليلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيرس سطح غلاف البذرة (مع وجود 23 G إبرة) قبل بذر البذور بحيث يتم السماح للمياه لدخول البذور ونقع في الماء طوال الليل. إضافة كمية كافية من الماء لتغطية كامل البذور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زرع بذور 3 في كل 15 سم وعاء القطر (ما مجموعه 10 قدور) في خليط بوتينغ (الخشنة الرمل، البيرلايت، جوز الهند الجفت (1: 1: 1)، بالإضافة إلى 5 غرام من Osmocote قياسي بالضبط: بطيئة الافراج الأسمدة) ونقل إلى البيوت الزجاجية. الإبقاء على أصح الشتلات بعد الإنبات حتى لا يكون هناك 1 مصنع في وعاء وتحيط بها تعريشة لمصنع ينبع في الصعود. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حاضن الحصاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع القرون من ثنوع ILD Jemalong أو 2HA للحصول على مراحل الجنين في وقت مبكر المناسبة كما وصفت لأول مرة 9. ملاحظة: يتم عرض المراحل جراب مختلفة في الشكل 1 وتظهر مراحل الجنين المقابلة في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق المراحل جراب مختلفة عند الحصاد باستخدام معايير حسب الجدول 1. قياس الوقت المنقضي من مرحلة 6 للمساعدة في مراحل منفصلة 6 و 7 (الجدول 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح البويضات من القرون والتحقق من مرحلة الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل البويضات من القرون باستخدام ملقط غرامة حدها أو مجهر تشريح ستيريو وملقط حسب الضرورة. إذا لزم الأمر في مرحلة الجنين يمكن التحقق بسرعة باستخدام مركب المجهر القياسي (الشكل 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعد المعدلة حل هوير التي تحتوي على 7.5 غرام الصمغ العربي، و 100 غرام الكلورال هيدرات، 5 مل الجلسرين، 60 مل منزوع الأيونات الماء المقطر. حل عن طريق التحريك لمدة 3-5 ساعة أو طوال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمزيد من صقلد المجهر مسح البويضات تشريح في حل 15،16 تعديل هوير و. اختيار بعناية حتى البويضات سليمة والمكان في حجم صغير من حل هوير و(ما يكفي لتغطية بويضة) في درجة حرارة الغرفة حتى واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض العينات مع تدخل الفرق النقيض (DIC) البصريات. التقاط الصور يؤته على كاميرا رقمية 9 (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البويضات الأكثر موحدة من المنطقة الوسطى من جراب وتتراكم العدد المطلوب. يتم عرض مثال في الشكل 3A. جمع البويضات على الجليد وتخزينها في درجة الحرارة المطلوبة (الأحماض -80 درجة مئوية لمدة النووية) لمزيد من التحليل. ملاحظة: لمزيد من التفاصيل على تحليل المقاطع النسيجية، انتقال المجهر الإلكتروني، والتهجين في الموقع يرجى الاطلاع على الأوراق 8،9. </li></ol></li></ol> 2. الجسدية تطور الجنين في المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام M. truncatula الصنف رقبعة قادرة على تشكيل بسهولة الأجنة في الثقافة. لهذا البروتوكول لإإكسبلنتس ورقة استخدام النباتات 2HA 13،17 تكون 2-4 أشهر من العمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ منشورات من أحدث ورقة ثلاثية الأوراق تقريبا توسعت بشكل كامل من جذع التطويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على أوراق ثلاثية الأوراق على رطبة ورقة المناشف في وعاء الثقافة لتجنب الجفاف. ملاحظة: مرة واحدة ويتم حصاد الأوراق ثلاثية الأوراق التي يحتاجونها لاستخدامها بأقل قدر من التأخير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مستنبت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام P4 10: المتوسط ​​5 في أجار (0.8٪ ث:: V) 4: 1 في 9 سم أطباق بتري. ملاحظة: P4 10: 4: 5: 1 المتوسطة يتكون من المتوسط ​​P4 القاعدية 18 بالإضافة إلى 10 ميكرومتر حمض 1-naphthaleneacetic (NAA)، 4 ميكرومتر 6-benzylaminopurine (BAP)، 1 ميكرومتر حمض التسقيط (ABA) و 5 ميكرومتر الجبرليك حمض (GA). استخدام GA + ABA يسرع تشكيل الجنين ويسبب زيادات حقيقية في الجنين الرقم 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل المتوسطة القاعدية P4 في 1 L؛ تتكون من أملاح الكبرى (جعل calciuم بشكل منفصل)، وأملاح بسيطة والفيتامينات (الجدول 3)، والحديد بالكلاب (الماكياج بشكل منفصل)، casamino الأحماض (الكازين حلامة)، 30 غرام السكروز، 8 غ أجار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول تخزين المخزون من أملاح الكبرى والكالسيوم والأحماض casamino والأملاح والفيتامينات طفيفة في -20 درجة مئوية في قسامات مناسبة. تخزين الحديد بالكلاب في 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل الحديد بالكلاب (200X) عن طريق إذابة 7.44 غرام من نا 2 EDTA • 2H 2 O في حوالي 900 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات مع التحريك، ثم جعل الحل ل98-99 ° C مع إضافة 1.853 غرام من FeSO 4 • 7H 2 O. أخيرا جعل ما يصل الى 1 L عندما تذوب المكونات. متجر في العنبر زجاجات في 4 درجات مئوية الملونة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل بصل متوسطة P4 مع حلول الأوراق المالية كما في الجدول رقم (4). والهرمونات في المتوسط ​​هي 10 ميكرومتر NAA، 4 ميكرومتر BAP، 1 ميكرومتر ABA، 5 ميكرومتر GA (انظر الجدول 4 ومواد محددة الجدول). إضافة NAAوBAP قبل التعقيم وإضافة ABA وGA بعد التعقيم والتبريد إلى حوالي 55 درجة مئوية، وذلك باستخدام التعقيم مرشح مع مرشح 0.22 ميكرون تعلق على حقنة. مزيج جيد من قبل يحوم طيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط وسائل الإعلام لدرجة الحموضة 5.8 مع 1 M KOH قبل التعقيم. الأوتوكلاف على درجة حرارة 121 مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التعقيم إضافة عامل تصفية تعقيمها ABA وGA، وتصب حوالي 25 مل من وسائل الاعلام الى معقمة 9 سم أطباق بتري في غطاء تدفق الصفحي أو مجلس الوزراء واقية. بارد، والسماح للأجار مع مجموعة الغطاء. ثم وضعت على غطاء والتأكد من عدم وجود المكثفات على الغطاء. التسمية كما هو مطلوب وتخزينها في 4 ° C (في صندوق من الورق المقوى لمنع غطاء المكثفات). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم ورقة الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل في غطاء تدفق الصفحي تعقيم الأشعة فوق البنفسجية أو مجلس الوزراء واقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان يترك في الكرة شبكة من الشاي المساعد على التحلل الربيع تعقيمها قبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج المساعد على التحلل الشاي تحتوي على أوراق في 70٪ (ت: ت) الايثانول في طريق مسدودوعاء البنية لمدة 30 ثانية. ملاحظة: للاستخدام في جميع الخطوات في هذا الإجراء 250 مل المسمار غطاء الأواني الثقافة البولي التي يتم تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف ومن ثم نقل وتزج الأنسجة ورقة في 1: 8 (ت: ت) التبييض المخفف (0.5٪ الكلور) لمدة 10 دقيقة. دوامة بلطف من وقت لآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف التبييض ونقل المساعد على التحلل الشاي في وعاء الثقافة التي تحتوي على الماء المقطر منزوع الأيونات معقمة. دوامة بلطف واستنزاف المياه الزائدة. كرر واحدة لمزيد من الوقت مع وعاء ثقافة جديدة من الماء المقطر منزوع الأيونات معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأوراق من الشاي المساعد على التحلل مع ملقط معقم لوعاء ثقافة جديدة من الماء المقطر منزوع الأيونات معقمة. المسمار على الغطاء العقيمة وشطف التي كتبها قلب ويحوم. ترك الأوراق تطفو على الماء المعقم حتى على استعداد لإعداد إإكسبلنتس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وتصفيح إإكسبلنتس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تقنيات معقمة، وتقليم منشورات تعقيم الفردية من الحافة مع مشرط، وقطع مستطيل المتبقية إلى اثنين أو عبتيه ه إإكسبلنتس مستطيلة الشكل (10/8 س 3-5 ملم) مع منتصف الوريد في وسط كل يزدرع (الشكل 5A). ملاحظة: حجم يزدرع مهم جدا في بدء callusing الأول. تنفيذ قطع على الجفن المعقمة من حاويات المواد الغذائية لاتولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 6 إإكسبلنتس على توطد أجار مستنبت في 9 سم القطر أطباق بتري (الشكل 5B). لوحة لل explants الجانب مجافي المحور وصولا الى الحفاظ على التوجه أوراق المعتاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم أطباق بتري مع parafilm (الشكل 5C) امتدت حول الطبق. النسيج هي الآن جاهزة للحضانة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة الحضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في الظلام عند 28 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة التي تسيطر عليها الحكومة أو النمو طوال الفترة الثقافة. ملاحظة: سيتم إإكسبلنتس بدء فقد التمايز، الخضوع لانقسام الخلايا وانتشارها (تكوين الكالس) ومرحلة التطور الجنيني (التمايز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية في expla التفريقاليلة بعد 3 أسابيع إلى متوسطة جديدة. في هذه ثقافة فرعية نقل يزدرع كله باستخدام معقم غير القابل للصدأ ملعقة الصلب وملقط، في غطاء تدفق الصفحي أو مجلس الوزراء واقية. كما يحدث callusing والكالس يتجاوز حجم أكبر واحد في الشكل 5C، ونقل 50٪ من الكالس الفردية عندما subculturing إلى متوسطة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الأجنة الأولى في حوالي 4 أسابيع. في حين أن هناك درجة من التزامن، وجمع مراحل الجنين المختلفة على مدى فترة حضانة 4-8 أسبوع (الشكل 6A، B). جمع تحت المجهر تشريح وعملية وفقا لأهداف تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية كل 3 أسابيع وإزالة الأجنة بشكل دوري بحيث إإكسبلنتس سوف تستمر في إنتاج الأجنة لمدة 3 أشهر. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference.">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li><li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes:+importance+and+constraints+to+greater+use.">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li><li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes.">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li><li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation.">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li><li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling.">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li><li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds.">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li><li>Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies:+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li><li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li><li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo.">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li><li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs.">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li><li>Birnbaum, K. D., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+across+kingdoms:+regeneration+in+plants+and+animals.">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li><li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis.">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li><li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis,+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula.">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).</li><li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development.">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li><li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+(SERK1)+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li><li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+embryogenesis+from+leaf+explants.">Somatic embryogenesis from leaf explants.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues.">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li><li>Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+seeds+and+embryos+of+Medicago+truncatula+cultured+in+vitro.">Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro.</a> Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).</li><li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula.">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

والبروتوكولات المذكورة هي نسبيا على التوالي إلى الأمام وتسمح بالتحقيق في مرحلة التطور الجنيني البقول مع كل خلية المعاصرة والتقنيات الجزيئية. نحن ندرك أن هناك مزايا وعيوب كل من المجراة في النهج المختبر. كلا السماح للمزيد من التركيز على مرحلة التطور الجنيني المبكر بالمقارنة مع ثقافة بذور غير ناضجة 19. في حالة الدراسات المجراة ما يوصف هو في الغالب بمعزل عن بويضة من جراب الذي هو مناسبة لكثير من الدراسات الجنين. ومن الممكن بالطبع لمزيد من إثراء للنسيج الجنين تشريح قبالة &quot;هوك&quot; منطقة (الشكل 3B) من قبل. فمن الصعب عزل المبكرة جدا مرحلة من مراحل تطور الجنين كما حدث أثناء disection غالبا ما يتم فقدان الجنين كما أنه لا تعلق جيدا إلى الأنسجة المجاورة، مما يجعل استخدام البويضات المفيد. باستخدام جراب التشكل يلغي وضع علامات على الزهور وامضوا وقتا جنظام رسي لكل زهرة. وبالإضافة إلى ذلك هناك تقلبات محتملة في أساليب توقيت التنموية ما لم يتم التحكم في بيئة بإحكام شديد. نمو النبات الأمثل هو في غاية الأهمية لا يحدث أن تشكيل جراب تحت ظروف الإجهاد. تعرف على تطوير جراب ويمكن إجراء تعديلات طفيفة على تحديد المراحل المورفولوجية لمباراة مراحل تطور الجنين محددة. في حالة الجنين الجسدية، لا بد من الاعتراف بأن الأجنة وتستمد اجنسيا وليس من البيضة الملقحة. أيضا، المصدر الغذائي يختلف عن الجنين اقحي. في حالة الجنين الجسدية، هو مستنبت والكالس المحيطة بها، وفي حالة الجنين اقحي هو السويداء. وهذا يعني أن أفضل بكثير تطوير suspensor في حالة الجنين اقحي (الشكل 4A، B). قيمة معينة من M. نظام truncatula هو عدد كبير من الأجنة ردا على غير المعتاد أربعة هرموننظام البريد. إذا كانت الأرقام الكبيرة لا تحدث ثم التدقيق في تفاصيل إختلاق الهرمونات وبالإضافة لوالمتوسطة يجب أن يتم التحقق. كما هو الحال مع أي العقم منهجية ثقافة النسيج النباتى دون ضرر (إجراء تعديلات صغيرة لتوقيت الإيثانول والأوقات التعقيم الهيبوكلوريت إذا كان هذا هو مشكلة) مهم جنبا إلى جنب مع الرعاية في الحفاظ على عقم خلال جميع الخطوات التحضيرية. ما وجدناه هو أنه قيمة لتكمل في الجسم الحي وفي عمليات المختبر. مثال من الدراسات الخاصة لدينا هو التحقيق في عامل النسخ MtSERF1 (EMBRYO جسدية ذات الصلة FACTOR 1) وهو استجابة الاثيلين عامل النسخ الجيني. اكتشف MtSERF1 لأول مرة في الأجنة الجسمية باستخدام رني، اندماج المروج-المكتب المركزي للاحصاءات وفي الموقع hybridisations. ثم تبين أن يتم التعبير عنها في مرحلة التطور الجنيني اقحي 20. دراسة التطور الجنيني البقول مهمة لحالتغذية أومان، واستخدام M. truncatula الأجنة جنبا إلى جنب مع التقنيات الخلوية والجزيئية المتاحة الآن يمكن أن تعزز هذا المجال. ويمكن الحصول على نظرة ثاقبة كيف يمكن أن يكون الأمثل حجم الجنين وبالتالي العائد معا لتكوين الكربوهيدرات والزيوت والبروتين المطلوبة. يتم تعيين هذه المحددات إلى حد كبير في قطار في مرحلة التطور الجنيني المبكر 8،9.

البقول هي ثالث أكبر عائلة من النباتات العليا مع ما يقرب من 20000 الأنواع والفيصلة القرنية (أو الفصيلة البقولية) الأسرة هي الثانية للحبوب في المساحة المحصودة والإنتاج الإجمالي 1. فول الصويا هو ثالث أكبر المحاصيل المزروعة. توفر البقوليات حوالي ثلث البروتين وثلث من الزيت النباتي للاستهلاك البشري 2. البقوليات مع قدرتها تحديد N 2 تسهم أيضا في النظم الزراعية المستدامة. Medicago truncatula، مثل فول الصويا، ومخازن البروتين والزيت في النبتات من البذور والبقوليات هو نموذج الوراثي والجيني مع الموارد الوراثية والجينوم كبيرة 3،4. في حين M. وقد مكن truncatula التقدم في فهم-البقوليات البكتريا العصوية تكافل 4 فقد استخدمت على نحو متزايد لدراسة البيولوجيا بذور البقول 5-7 والتخلق 8،9. تم نبات الأرابيدوبسيس مرحلة التطور الجنيني درس على نطاق واسع 10،11 كنها طسا غير البقوليات وتفاصيل مرحلة التطور الجنيني ليست متطابقة إلى Medicago 8،10. التطور الجنيني اقحي في M. truncatula ديها ميزات مثيرة للاهتمام، مع الغدة النخامية متعددة الخلايا المميزة، وهي suspensor endoployploid ونقل الخلية القاعدية 8. يستخدم مرحلة التطور الجنيني الجسدية (SE) عادة لتجديد النباتات 12. في نموذج البقوليات M. truncatula، خط البذور Jemalong 2HA (2HA) تم تطويره من الوالد Jemalong أن يكون ارتفاع معدلات التطور الجنيني الجسدية 13. وقد تم مؤخرا زيادة عدد الأجنة المنتجة بشكل جوهري بإضافة كل من حمض الجبريليك (GA) وحمض التسقيط (ABA) إلى متوسطة عريقة 14. في هذه الحالة GA والعمل ABA تآزر، وهو أمر غير معتاد نظرا لأن GA وABA عادة ما تتصرف بعدوانية 14. الأجنة المنتجة من الكالس تتطور على السطح الذي يسمح مرحلة التطور الجنيني يتم تحديدها بسهولة بصرياذ وتحصد بسهولة. وجود بالقرب من خطوط إسوي التي تخلقي (2HA) وغير تخلقي (Jemalong) يسهل التحقيق في مرحلة التطور الجنيني الجسدية وجود كل المجراة في أنظمة المختبر يوفر إمكانيات التجريبية المختلفة. فهم الآليات الخلوية والجزيئية لتطور الجنين هو ضروري لبذور التفاهم وتطوير المصنع. في البقوليات، كما هو الحال في الفلقتين أخرى، فمن النبتات من الجنين الذي تخزين المنتجات التي تستخدم لتغذية الإنسان. مرحلة التطور الجنيني المبكر ينطوي على انقسام الخلايا السريع والصحيح الجنين الزخرفة. في بعد حوالي 8 أيام الإخصاب، M. truncatula الجنين تصل إلى مراحل فلقة في وقت مبكر. لا يتم الإشارة إلى الخصائص المورفولوجية بالضبط قبل أيام بعد الإخصاب في ظروف البيوت الزجاجية. وهكذا، وهو نهج موحد فعال للإشارة إلى مرحلة الأجنة النامية قيمة في دراسة regul الجينيأوجه من أوائل مرحلة التطور الجنيني اقحي. في هذه الورقة، ونحن نقدم اثنين من بروتوكولات موحدة لجمع الأجنة النامية للدراسات البيولوجية للمرحلة التطور الجنيني في نموذج البقول M. truncatula. أول واحد هو جمع الأجنة اقحي من خلال ربط التطور الجنيني وجراب التشكل في حين أن الثانية هي مرحلة التطور الجنيني الجسدية عبر إإكسبلنتس أوراق زراعة لتوفير أعداد كبيرة الجنين الوصول إليها بسهولة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >P4 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Major salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minor salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vitamins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Bacto agar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plant hormones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Abscisic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1049</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Benzylaminopurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3274</td>
			<td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gibberellic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7645</td>
			<td>Dissolve in small amount of ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZFLIII</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiophot</td>
			<td>Or similar, with suitable optics</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Digital camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam HRc</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilising leaves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>75.9922.519</td>
			<td>Autoclavable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

مرحلة التطور الجنيني المبكر بدءا من البيضة الملقحة خلية واحدة يمر انقسام الخلايا السريع والتشكل، ويتميز شكليا لما قبل كروي، كروي، والقلب، ونسف فلقة مراحل. هذا التطور التدريجي تحت تنظيم محكم من شبكة الجزيئية المعقدة. حصاد الأجنة المبكرة كافية في مرحلة مماثلة من التنمية ضروري لتحقيق التنظيم الخلوي والجزيئي للمرحلة التطور الجنيني المبكر. هذه ليست واضحة منذ مرحلة التطور الجنيني المبكر يخضع التشكل السريع في فترة قصيرة على سبيل المثال 8 أيام لMedicago truncatula للوصول إلى مرحلة فلقة في وقت مبكر. هنا، نعالج هذه القضية من خلال النهجين. أول واحد بتأسيس الربط بين تطور الجنين وجراب التشكل في مساعدة تشير إلى مرحلة من مراحل الجنين اقحي. ويستند هذا بشكل خاص على عدد من اللوالب جراب والتنمية في العمود الفقري. وسيلة بديلة لتكمل في الجسم الحي الصورةtudies هو عن طريق إإكسبلنتس أوراق زراعة لإنتاج الأجنة الجسمية. يتضمن المتوسطة تركيبة هرمون غير عادي - وأوكسين (حمض 1-naphthaleneacetic)، وهو سيتوكينين (6 benzylaminopurine)، حمض التسقيط وحمض الجبريليك. مراحل مختلفة يمكن تمييزها المتزايد من الكالس دون تشريح.

وتظهر لمرحلة التطور الجنيني مختلف الهياكل جراب اقحي المقابلة لمراحل الجنين المختلفة في الشكل 1A - F بينما أظهرت مراحل الجنين المختلفة في الشكل 2A - F. عن طريق اختيار القرون في نفس المرحلة، وعينات من البويضات التي هي موحدة تماما ويمكن الحصول على (الشكل 3A). باستخدام RT-QPCR الجنين جينات معينة يمكن الكشف بسهولة والدراسات دوام تقييم 9. وبعض تشريح إضافي يسمح لمزيد من التخصيب للجنين (الشكل 3B). تجهيز لفي الموقع استراتيجيات التهجين يمكن أن يتم بسهولة من فضلا عن أي دراسات تكميلية تنطوي على ضوء (الشكل 4A، B) والمجهر الإلكتروني 8. من قيمة خاصة في هذا النظام هو تميز (4A الشكل، B) الغدة النخامية وsuspensor. لتكوين الجنين الجسدية وجويظهر في Utting من يزدرع الأولي من folioles فرد في الشكل 5A. ثم يتم وضع إإكسبلنتس الجانب مجافي المحور حتى على اتصال وثيق مع أجار (الشكل 5B). بعد الكالس الأجنة تشكيل تبدأ في الظهور بعد 3-4 أسابيع وبنسبة 7 أسابيع هناك العديد من الأجنة في مرحلة فلقة (الشكل 5C). باتباع اللوحات خلال أسابيع بين 4 و 7 أجنة في مراحل منفصلة يمكن أن يكون موجودا (الشكل 6A، B). مراحل الجنين مختلفة يمكن ملاحظتها بسهولة واختار ببساطة الخروج للتحليل. هذا يمكن أن يكون الى حد بعيد وسيلة سريعة لكسب أنواع معينة من المعلومات. على سبيل المثال يوضح الشكل 7 كيف أظهرت الأجنة في مرحلة مبكرة فلقة التعبير عن نوع واحد من MtOLEOSIN الجينات ولكن ليس آخر. ويمكن بعد ذلك فحص الدراسي: دوام دراسات الجينات ذات الاهتمام باستخدام اقحي أو الأجنة الجسمية. وهناك ميزة خاصة من النظام الجنين الجسدية هي أن التحول من calluالصورة يمكن القيام بها دون تجديد مصنع كامل والتعبير الجيني في مراحل مختلفة من التطور الجنيني تصور باستخدام المكتب المركزي للاحصاءات (β غلوكورونيداز) أو تسميات الفلورسنت. يتم عرض مثال في الشكل 6C. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52635/52635fig1.jpg" /> الشكل 1: قرنة التشكل ومراحل تطور الجنين حاضن في مراحل مختلفة من التنمية مع الأجنة في مراحل منفصلة. مراحل 07/02 المشار إليه. (A) و (B) هي المراحل 2 و 3 في وقت مبكر جدا وأوائل مسبقا كروية (C) المرحلة 4 مبكرة كروية (D) المرحلة 5 أواخر كروي (E) المرحلة 6 القلب و(F) المرحلة 7 الراحل طوربيد. شريط هو 2 مم. المرحلة الأولى هي المزهرة (لا يظهر). <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52635/52635fig2.jpg" /> الشكل 2: مراحل تطور الجنين. &lt;/ قوي&gt; الأجنة مسح في مراحل التنمية المختلفة. (A) المرحلة 3 في وقت مبكر قبل كروية، (B) المرحلة 4 كروي في وقت مبكر، (C) المرحلة 5 أواخر كروي، (D) المرحلة 6 القلب، و (E) المرحلة 7 الراحل طوربيد. شريط 60 ميكرون. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52635/52635fig3.jpg" /> الرقم 3: عزل البويضات (A) مجموعة من البويضات مع المرحلة 5 أجنة. (B) بويضة ينظر تحت المجهر المركب القياسي لاظهار الجنين الذي يمكن رفعه في نهاية &quot;هوك&quot;. الشريط 1 مم (A) و 200 ميكرون (B). <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52635/52635fig4.jpg" /> الرقم 4: مورفولوجية الجنين في وقت مبكر (A) القسم من خلال عرض الجنين في وقت مبكر جداالجنين السليم (أربع خلايا)، الغدة النخامية (الخلايا الأربع المقبلة)، suspensor (الخلايا الأربع المقبلة التي لها فجوات كبيرة) والعلاقة جي إلى الأنسجة بويضة. (B) القسم من خلال نسف أوائل مرحلة الجنين (E) مع suspensor بارز (S). ملطخة طولويدين الأزرق. شريط 10 ميكرون (A) و 50 ميكرون (B). <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52635/52635fig5.jpg" /> الرقم 5: زراعة إإكسبلنتس لإنتاج الأجنة الجسمية (A) تبين ورقة ثلاثية الوريقات التي يتم فيها اتخاذ إإكسبلنتس من foliole. (B) إإكسبلنتس مطلي على أجار. (C) الأجنة الجسدية الناتجة عن إإكسبلنتس بعد ثقافة 7 أسابيع. شريط مم IS10 <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52635/52635fig6.jpg" /> الشكل 6: مراحل الجنين الجسدية وتحديد موقع expressio الجيناتن باستخدام التحول والمكتب المركزي للاحصاءات. (A) الأجنة الجسمية في كروي (G) والقلب (H) ونسف (T) مراحل. (B) الأجنة الجسدية في مرحلة مبكرة فلقة. (C) مع عقيدية مرحلة الجنين الجسدية تظهر التعبير المكتب المركزي للاحصاءات القوي لهذا الجين MtWOX9 في الجنين السليم (E) وخفض تلطيخ في الغدة النخامية (H) و (S) suspensor. شريط (A، B) هو 100 ميكرون. شريط (C) هو 50 ميكرون. <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/52635/52635fig7.jpg" /> الرقم 7: التعبير الجيني دوينج مرحلة التطور الجنيني في المختبر باستخدام البلمرة الكمية التفاعل (QPCR) التعبير الجيني من OLEOSIN3 (A) وOLEOSIN4 (B) في الأجنة مرحلة مبكرة فلقة رفعه من الأجنة من الكالس تخلقي. التعبير ر النسبيس رقة. وأشارت الأخطاء المعيارية. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عدد مرحلة </td><td> مرحلة الجنين </td><td> المرحلة جراب </td></tr><tr><td> المرحلة 1 </td><td> زهرة في anthesis </td><td></td></tr><tr><td> المرحلة 2 </td><td> في وقت مبكر جدا الجنين قبل كروي </td><td> جراب مع واحد أو اثنين من اللوالب </td></tr><tr><td> المرحلة 3 </td><td> في وقت مبكر الجنين قبل كروي </td><td> جراب مع ثلاثة اللوالب كاملة </td></tr><tr><td> المرحلة 4 </td><td> كروي في وقت مبكر </td><td> جراب مع خمسة اللوالب كاملة والعمود الفقري غير مرئية </td></tr><tr><td> المرحلة 5 </td><td> كروي الراحل </td><td> جراب مع ستة اللوالب والعمود الفقري غير ناضجة لا يتجاوز عرض جراب </td></tr><tr><td> المرحلة 6 </td><td> المرحلة القلب </td><td> جراب مع ستة اللوالب وممدود تستحق العمود الفقري يتجاوز عرض جراب </td></tr><tr><td> المرحلة 7 </td><td> نسفالمسرح </td><td> جراب مع ستة اللوالب، تنضج العمود الفقري أطول سمكا وزيادة مقاس </td></tr></tbody></table> الجدول 1: معايير حصاد مراحل جراب المعايير الشكلية المستخدمة في تحديد مراحل جراب المقابلة لمراحل الجنين محددة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> زهرة المرحلة 1 (S1) </td><td> جراب المرحلة 2 (S2) </td><td> جراب المرحلة 3 (S3) </td><td> جراب المرحلة 4 (S4) </td><td> جراب المرحلة 5 (S5) </td><td> جراب المرحلة 6 (S6) </td><td> جراب المرحلة 7 (S7) </td></tr><tr><td> أيام </td><td> 0 </td><td> 1.5-2 </td><td> 0.5-1 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5-1 </td><td> 1 </td><td> 1-1.5 </td></tr></tbody></table> الجدول بالطبع 2. الوقت لجمع جراب الساعة من رانه السابقة مرحلة تطور الجنين وأشارت في غضون أيام. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> أملاح الرئيسية / L </td><td colspan="2"> أملاح بسيطة / L </td><td colspan="2"> الفيتامينات / L </td></tr><tr><td></td><td> ملغ </td><td></td><td> ملغ </td><td></td><td> ملغ </td></tr><tr><td> كنو 3 </td><td> 1875 </td><td> MnSO 4 • H 2 O </td><td> 10 </td><td> ميو-إينوسيتول </td><td> 100 </td></tr><tr><td> NH 4 NO 3 </td><td> 600 </td><td> H 3 BO 3 </td><td> 3 </td><td> الثيامين حمض الهيدروكلوريك </td><td> 10 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 131 </td><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 2 </td><td> حمض النيكوتينيك </td><td> 1 </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 225 </td> &lt;td&gt; KI </td><td> 0.75 </td><td> البيريدوكسين هيدروكلوريد </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgSO 4 • 7H 2 O </td><td> 225 </td><td> غ 2 وزارة النفط 4 • 2H 2 O </td><td> 0.25 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> الكالسيوم منفصل </td><td> كبريتات النحاس 4 • 5H 2 O </td><td> 0.025 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td> 300 </td><td> كوكلي 2 • 6H 2 O </td><td> 0.025 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> الحديد بالكلاب منفصلة </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> FeSO 4 • 7H 2 O </td><td> 9،267 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> نا 2 EDTA • 2H 2 O </td><td> 37.2 </td><td></td><td&gt; </td></tr></tbody></table> الجدول 3: P4 المتوسطة من مكونات المتوسطة P4. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكون </td><td> كمية / L </td></tr><tr><td> 10 × الأملاح الرئيسية </td><td> 100 مل </td></tr><tr><td> 100 × الكالسيوم </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> 1000 س أملاح بسيطة </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> 200 × الحديد </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> 100 × casamino الأحماض </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> 1000 س الفيتامينات </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> سكر القصب </td><td> 30 ز </td></tr><tr><td> أجار </td><td> 8 ز </td></tr><tr><td> الهرمونات </td><td></td></tr><tr><td> 1000 ميكرومتر NAA </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> 1000 ميكرومتر BAP </td><td> 4 مل </td></tr><tr><td> 1000 ميكرومتر ABA </td><td> 1 مل </td> &lt;/ tr&gt; <tr><td> 1000 ميكرومتر GA </td><td> 5 مل </td></tr></tbody></table> الجدول 4: جعل فوق المتوسطة P4 مع الهرمونات التي تشكل المتوسطة P4 مع الهرمونات من الحلول الأسهم.

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula at JoVE.co

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

بروتوكولات الحصول اقحي والجسدية الأجنة لدراسة تنظيم تطور الجنين في وقت مبكر من البقول نموذج<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

13.9K Views.  University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia. The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided. 

Video: Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

إعداد مكتبات RNA الصغيرة لتسلسل من أجنة الماوس المبكر

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

بروتوكول للكيمياء النسيجية المناعية وتوزيع الحمض النووي الريبي في الموقع داخل جنين ذبابة الفاكهة المبكر

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

نظام O9-1/Hydrogel محسن لدراسة الإشارات الميكانيكية في خلايا كريست العصبية

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة للأنسجة الدهنية للفئران للتمايز إلى خلايا منتجة للأنسولين

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...